Электрофорез био егэ

Спрятать пояснение

За это задание ты можешь получить 1 балл. Уровень сложности: базовый.
Средний процент выполнения: 53.2%
Ответом к заданию 1 по биологии может быть цифра (число) или слово.

Задачи для практики

Нововведения в оценивании второй части ЕГЭ по биологии

• Задание 23. Содержит от 3 до 4 критериев. Если ответ включает в себя все названные элементы, полагается 3 балла.
• Задание 26. Это задание, посвященное темам «эволюция» или «экология», подразумевает от 3 до 6 элементов ответа. Чтобы получить 3 балла, нужно осветить не менее 4 критериев (иногда не менее 5).
• Задание 27. Содержит от 3 до 4 критериев. Четвертым элементом, как правило, является объяснение. Если ответ включает в себя все (3 или 4) названные элементы, полагается 3 балла.

Советы педагогу

• Научите ребят определять количество критериев в вопросе. В формулировке обязательные элементы ответа не всегда могут быть очевидны. 
• Объясните, что ответы не должны быть бытовыми.
• Напомните, что в заданиях на поиск ошибок утверждения не исправляются путем простого отрицания.
• Повторите с учениками принципы оформления решений задач по генетике (правила прописаны в учебниках).
• Обратите особое внимание на вопросы 19, 20, 21 первой части. Даже «сильные» дети, олимпиадники, делают ошибки в этих простых заданиях из-за невнимательности и неумения анализировать задачу. А чтобы подготовиться к ЕГЭ по биологии основательно и свести вероятность ошибки к минимуму, можно заглянуть в Справочник, выпущенный специально для подготовки к итоговому испытанию. 

Тема: Биология как наука

Каким методом и в какой фазе деления изучается кариотип человека? Что выясняется этим методом?

Элементы ответа

1. Метод цитогенетический (микроскопия); фаза, в которой хорошо видны хромосомы — метафаза.
2. Этим методом определяют наличие хромосомных или геномных мутаций и наличие (или отсутствие) наследственных заболеваний.

Комментарий. Тема «методы исследования» достаточно трудна для усвоения выпускниками. Именно поэтому необходимо обращать внимание на точность формулировки.

Ответ выпускника № 1

1. Этот метод генетический. 2. С его помощью можно посчитать количество мутаций и узнать пол человека.

Комментарий. Оценка экспертов – 0 и 1 балл. Сказано про пол.

Ответ выпускника № 2

1. Этот метод микроскопический. 2. С его помощью рассматривают строение хромосом в метафазе.

Комментарий. Оценка экспертов – 1 балл. Названы метод и фаза деления клетки.

В чем заключается суть метода микроклонального размножения растений?

Элементы ответа

1. Этот метод применяется для выращивания культур клеток и тканей растений.
2. Некоторое количество клеток помещают в питательную среду и выращивают определенное время.
3. При добавлении гормонов, обеспечивающих рост и дифференцировку клеток, получают рассаду растений, которые потом высаживают на поля.

Ответ выпускника

1. Этим методом размножают растения. 2. Их выращивают из кусочков ткани (каллус). 3. Выращенные саженцы высаживают на поля.

Комментарий. Оценки экспертов – 1 и 2 балла. Ответ не содержит биологических ошибок, но он не проясняет сути метода: не сказано о необходимости специальной среды для выращивания, об обработке культуры гормонами, дифференцировке клеток и формировании полноценного растения.

Какие методы исследования позволили экспериментально доказать, что ДНК реплицируется полуконсервативным путем?

Элементы ответа

1. Применялись методы меченых атомов и центрифугирования.
2. Полуконсервативный способ репликации ДНК был доказан с помощью изотопа N15 и последующего разделения смеси ДНК на две фракции с двумя изотопами азота и N14.

Ответ выпускника № 1

1. Применялся биохимический метод. 2. Этим методом доказали, что ДНК реплицируется.

Комментарий. Оценка экспертов – 0 баллов. Ответ содержит ошибки и не отвечает смыслу вопроса.

Ответ выпускника № 2

1. Применялся метод центрифугирования смеси молекул ДНК. 2. Было выделено два вида ДНК: старая и новая.

Комментарий. Оценка экспертов – 1 балл. Выпускник указал второй из методов исследования (центрифугирование) и пояснил, что была старая и новая ДНК. Ответ неполный. Не указан ни метод меченых атомов, ни его суть в данном эксперименте.

Тема: Клетка как биологическая система

Какие особенности строения молекулы воды обеспечивают выполнение ее функций в организме?

Элементы ответа

1. Полярность молекул воды определяет ее функции растворителя солей, кислот и других гидрофильных соединений, входящих в состав слизей, секретов.
2. Наличие водородных связей определяет ее теплопроводность, плотность.

Комментарий. Приведенные примеры ответов не являются единственно возможными. Важно, чтобы ответ не искажал смысла вопроса и не содержал биологических ошибок.

Ответ выпускника № 1

1. Вода – хороший растворитель. 2. Вода замерзает при 0 градусов.

Комментарий. Оценка экспертов – 0 баллов. Нет связи между строением и функциями воды.

Ответ выпускника № 2

1. Молекулы воды полярны, поэтому в ней гидрофильные вещества диссоциируют на ионы. 2. Вода имеет три агрегатных состояния и может обладать разными свойствами.

Комментарий. Оценка экспертов – 1 балл. Второй ответ не соответствует смыслу вопроса

Найдите три ошибки в приведенном тексте. Укажите номера предложений, в которых они допущены, объясните их.

(1)Белки — это нерегулярные биополимеры, мономерами которых являются нуклеотиды. (2)Остатки мономеров соединены между собой пептидными связями. (3)Последовательность мономеров, удерживаемая этими связями, формирует первичную структуру белковой молекулы. (4)Следующая структура — вторичная, удерживается слабыми гидрофобными связями. (5)Третичная структура белка представляет собой скрученную молекулу в виде глобулы (шара). (6)Удерживается такая структура водородными связями. (7)Четвертичная структура представлена комплексом глобул, находящихся в третичной структуре.

Элементы ответа.

1. Ошибки допущены в предложениях 1, 4, 6.
2. 1 — Мономерами белков являются аминокислоты.
3. 4 — Вторичная структура удерживается водородными связями.
4. 6 — Третичная структура белка удерживается ковалентными дисульфидными, ионными, гидрофобными и другими связями.

Ответ выпускника

Ошибки допущены в предложениях 1, 4, 6. 1 — Мономерами белков нуклеотиды не являются. 4 — Вторичная структура удерживается водородными связями. 6 — Третичная структура не удерживается водородными связями.

Комментарий. Оценка экспертов – 1 балл. Балл получен за второй критерий. Остальные предложения исправлены неверно простым отрицанием «не».

Найдите три ошибки в приведенном тексте. Укажите номера предложений, в которых они допущены, и объясните их.

(1)Быстрое протекание химических реакций в организме обеспечивают ферменты. (2)Один фермент катализирует несколько разных реакций. (3)Так, например, фермент, расщепляющий белки, может расщеплять и жиры. (4)По химической природе ферменты — это только белковые молекулы. (5)Они (ферменты) не изменяются по своему химическому составу в результате реакции. (6)Каждая молекула фермента может осуществлять несколько тысяч операций в минуту. (7)Активность ферментов зависит от его количества, температуры, и рН-среды.

Элементы ответа

1. Ошибки допущены в предложениях 2,3,4
2. 2 — Каждый фермент катализирует одну определенную реакцию.
3. 3 — Фермент, расщепляющий белок, не взаимодействует с жирами. Ферменты специфичны по отношению к субстрату.
4. 4 — Ферменты могут быть образованы комплексами с небелковыми компонентами — витаминами, металлами.

Ответ выпускника

Ошибки допущены в предложениях 1, 2, 5. 1 — Ферменты и гормоны расщепляют химические вещества. 2 — Один фермент — одна реакция. 5 — В результате реакции фермент разрушается и на его место приходит новый.

Комментарий. Оценки экспертов 0 и 1 балл. Исправление ошибки во втором предложении может быть истолковано экспертами по-разному. Главное слово в задании: разные. Выпускник написал «одна», а не несколько. Может возникнуть вопрос: всего одна или один тип реакций (что имел в виду выпускник?).

Какими путями вещества могут поступать в клетку?

Элементы ответа

Вещества могут поступать в клетку путем:

1. диффузии и осмоса по градиенту концентрации;
2. активного ионного транспорта (калий-натриевый насос) или с участием транспортных белков;
3. фагоцитоза и пиноцитоза.

Ответ выпускника

1. Вещества поступают в клетки через кровь, путем инъекций. 2. Из внешней среды путем пиноцитоза и фагоцитоза. 3. В процессе дыхания — кислород в ткани, а углекислый газ из тканей.

Комментарий. Оценка экспертов 1 балл. На апелляции возможно отстоять еще один балл: выпускник, по существу, ответил правильно, обозначив пути проникновения веществ в клетку. Однако — не понял вопроса. Более точными были бы вопросы: «Какими способами вещества поступают в клетку из внешней среды?», «Какие „механизмы“ обеспечивают поступление веществ в клетку?», «Какими путями вещества проникают в клетку через клеточную мембрану?».

В аппарате Гольджи различают два полюса. Один расположен ближе к эндоплазматической сети, другой – к цитоплазматической мембране. Как такое положение связано с функциями органоида? Для каких клеток это может быть наиболее характерно?

Элементы ответа

1. Аппарат Гольджи накапливает вещества, синтезируемые на эндоплазматической сети.
2. В мембранных пузырьках синтезированные вещества направляются к цитоплазматической мембране и удаляются из клетки.
3. Аппарат Гольджи лучше всего развит в клетках эндокринных желез и желез внешней секреции, а также в синапсах.

Ответ выпускника

1. Аппарат Гольджи переносит от ЭПС к цитоплазматической мембране синтезируемые на ЭПС вещества. 2. Эти вещества удаляются из клетки через плазматическую мембрану и идут к местам своей активности. 3. Больше всего этого органоида в клетках эпителиальной ткани.

Комментарий. Оценки экспертов – 2 и 3 балла. В третьем пункте нет точного ответа на вопрос. Тем не менее, сам вопрос поставлен так, что допускает данный ответ, который не содержит биологических ошибок и соответствует смыслу вопроса. Если бы спрашивалось «Для каких структур или органов….?», тогда ответ мог быть не засчитан.

Как строение цитоплазматической мембраны связано с выполняемыми ею функциями?

Элементы ответа

1. Двойной слой липидов мембраны обеспечивает избирательное проникновение веществ в клетку.
2. Встроенные белки выполняют транспортную, строительную, сигнальную функции.
3. Углеводы гликокаликса выполняют сигнальную и строительную функции.
4. Пластичность мембраны обеспечивает функции фаго- и пиноцитоза.

Ответ выпускника № 1

1. Мембрана состоит из липидов и белков. 2. Через мембрану проникают вещества в клетку и удаляются из нее. 3. Строение мембраны позволяет ей выполнять много функций.

Комментарий. Оценка экспертов – 0 баллов.

Ответ выпускника № 2

1. Мембрана обладает избирательной проницаемостью благодаря бислою липидов и обеспечивает активный транспорт благодаря транспортным белкам. 2. Мембрана клеток у животных способна изменять форму. 3. Это свойство обеспечивает возможность фагоцитоза и пиноцитоза.

Комментарий. Оценка экспертов – 2 или 3 балла. Ответ содержит основные пункты эталона.

Тема: Метаболизм — энергетический и пластический обмен веществ, фотосинтез

Чем отличаются реакции ассимиляции от реакций диссимиляции в процессе обмена веществ?

Ответы на этот и другие вопросы легко найти в учебнике «Биология. Углубленный уровень» для 11 класса.

Элементы ответа

1. При реакциях ассимиляции образуются вещества более сложные, чем вступившие в реакцию.
2. Реакции ассимиляции протекают с затратой энергии.
3. При реакциях диссимиляции происходит образование более простых веществ.
4. Реакции диссимиляции идут с выделением энергии.

Ответ выпускника

1. При ассимиляции образуются новые органические вещества особи, а при диссимиляции они разрушаются с образованием более простых веществ. 2. Первый процесс идет с поглощением энергии, а второй – с выделением энергии. 3. Таким образом, эти два процесса противоположны по своим результатам.

Комментарий. Оценка экспертов – 3 балла. Ответ полностью соответствует смыслу вопроса, это один из возможных вариантов ответа.

Как вы понимаете фразу: Код ДНК однозначен, триплетен, вырожден?

Элементы ответа

1. Код «триплетен» означает то, что каждая из аминокислот кодируется тремя нуклеотидами.
2. Код «однозначен» означает, что один кодон соответствует определенной аминокислоте.
3. Код «вырожден» означает, что одна аминокислота может кодироваться несколькими кодонами.

Ответ выпускника

1. Код триплетен — означает, что код состоит из трех кодонов. 2. Код однозначен — означает, что три нуклеотида кодируют последовательность аминокислот в белке. 3. Код вырожден — значит, что не все триплеты кодируют аминокислоты и их последовательность в белке.

Комментарий. Оценка экспертов – 0 баллов. Все ответы содержат биологические ошибки. Третий вариант не относится к понятию «вырожденность».

Найдите ошибки в приведенном тексте. Укажите номера предложений, в которых они допущены, объясните их.

(1)Клетки зеленых растений, используя энергию солнечного света, способны синтезировать органические вещества. (2)Исходными веществами для фотосинтеза служат углекислый газ и азот атмосферы. (3)Процесс фотосинтеза как в прокариотических, так и в эукариотических клетках происходит в хлоропластах. (4)В световой стадии фотосинтеза происходит синтез АТФ и разложение воды — фотолиз. (5)В темновой стадии фотосинтеза образуются глюкоза и кислород. (6)Энергия АТФ, запасенная в световой стадии, расходуется на синтез углеводов.

Элементы ответа

1. Ошибки допущены в предложениях 2, 3, 5.
2. 2 — Атмосферный азот не участвует в процессах фотосинтеза. Участвуют углекислый газ и вода.
3. 3 — Только цианобактерии способны к фотосинтезу, остальные прокариоты к нему не способны. (или: У фотосинтезирующих цианобактерий в клетках отсутствуют хлоропласты. Остальные прокариоты не фотосинтезируют).
4. 5 — В темновой фазе фотосинтеза кислород не выделяется.

Ответ выпускника № 1

Ошибки допущены в предложениях 2, 3, 5. 2 — В фотосинтезе азот не участвует, а участвуют вода и углекислый газ. 3 — Прокариоты к фотосинтезу не способны. 5 — В темновой стадии фотосинтеза образуются глюкоза и АТФ.

Комментарий. Оценка экспертов – 1 балл. Ответы к предложениям 2 и 3 не содержат исправление ошибок. Ответ к пятому предложению ошибочен.

Ответ выпускника № 2

Ошибки допущены в предложениях 2, 3, 5. 2 — Вторым исходным веществом является вода, а не азот. 3 — Не все прокариоты способны к фотосинтезу. 5 — Кислород образуется в световой стадии.

Комментарий. Оценка – 2 балла. Не все требования к исправлению ошибок соблюдены.

Последовательность аминокислот во фрагменте молекулы белка следующая: АЛА — ПРО — ЛЕЙ. Определите, пользуясь таблицей генетического кода, кодоны иРНК и триплеты ДНК, которые кодируют эти аминокислоты. Какое свойство генетического кода иллюстрирует это задание?

Элементы ответа

1. Аминокислота АЛА кодируется следующими триплетами иРНК: ГЦУ, ГЦЦ, ГЦА, ГЦГ. Следовательно, на ДНК ее кодируют триплеты ЦГА , ЦГГ, ЦГУ, ЦГЦ.
2. Аминокислота ПРО кодируется следующими триплетами иРНК: ЦЦУ, ЦЦЦ, ЦЦА, ЦЦГ. Следовательно, на ДНК ее кодируют триплеты ГГА, ГГГ, ГГТ, ГГЦ.
3. Аминокислота ЛЕЙ кодируется триплетами и-РНК: УУА, УУГ, ЦУЦ, ЦУА, ЦУГ, ЦУУ. Следовательно, на ДНК ее кодируют триплеты: ААТ, ААЦ, ГАГ, ГАТ, ГАЦ, ГАА.
4. Задание иллюстрирует такое свойство генетического кода как вырожденность.

Ответ выпускника

1. Пользуясь таблицей генетического кода иРНК, я определил, что аминокислота АЛА кодируется следующими триплетами иРНК: ГЦУ, ГЦЦ, ГЦА, ГЦГ. 2. Аминокислота ПРО кодируется следующими триплетами иРНК: ЦЦУ, ЦЦЦ, ЦЦА, ЦЦГ. 3. Аминокислота ЛЕЙ кодируется триплетами УУА, УУГ, ЦУЦ, ЦУА, ЦУГ, ЦУУ. Следовательно, код вырожден.

Комментарий. Оценка экспертов – 2 балла. Эксперты снизили оценку на 1 балл, так как выпускник не написал цепей ДНК, кодирующих информацию. Ошибка в трех пунктах одинаковая.

Фрагмент цепи ДНК имеет последовательность нуклеотидов ТТТАГЦТГТЦГГААГ. В результате произошедшей мутации в третьем триплете третий нуклеотид заменен на нуклеотид А. Определите последовательность нуклеотидов на иРНК по исходному фрагменту цепи ДНК и измененному. Что произойдет с фрагментом полипептида и его свойствами после возникшей мутации ДНК? Дайте объяснение, используя свои знания о свойствах генетического кода.

Элементы ответа

1. Последовательность нуклеотидов на и-РНК определяется по исходному фрагменту цепи ДНК — АААУЦГАЦАГЦЦУУЦ по принципу комплементарности.
2. Последовательность на и-РНК определяется по измененному фрагменту цепи ДНК — АААУЦГАЦУГЦЦУУЦ.
3. Фрагмент полипептида и его свойства не изменяются, так как триплеты АЦА и АЦУ кодируют одну аминокислоту ТРЕ — следовательно, генетический код вырожден (избыточен).

Ответ выпускника

1. Последовательность на и-РНК по исходному фрагменту цепи ДНК – АААУЦГАЦАГЦЦУУЦ. 2. Последовательность на и-РНК по измененному фрагменту цепи ДНК АААУЦГАЦУГЦЦУУЦ. 3. фрагмент полипептида и его свойства не изменяются.

Комментарий. Оценка экспертов – 1 балл. Ответ верный, но без объяснений. Нужно полностью выполнять требования заданий!

Тема: Хромосомы, их число, форма и размеры, видовое постоянство. Митоз, мейоз. Их сходство и отличие; значение. Развитие половых клеток у растений и животных

У шимпанзе в соматических клетках 48 хромосом. Определите хромосомный набор и число молекул ДНК в клетках перед началом мейоза, в анафазе мейоза I и в профазе мейоза II. Объясните ответ в каждом случае.

Элементы ответа

1. Перед началом мейоза набор хромосом и ДНК равен 2n4c; в конце интерфазы произошло удвоение ДНК, хромосомы стали двухроматидными; 48 хромосом и 96 молекул ДНК.
2. В анафазе мейоза I число хромосом и ДНК в клетке не изменяется и равно 2n4c.
3. В профазу мейоза II вступают гаплоидные клетки, имеющие набор из двухроматидных хромосом с набором n2c; 24 хромосомы и 48 молекул ДНК.

Ответ выпускника

1. Перед мейозом набор 2n4c. 2. В анафазе мейоза I число хромосом гаплоидное n2c. 3. В профазе II число хромосом равно 24, число молекул ДНК — 48.

Комментарий. Оценки экспертов 0 и 1 балл. Задание требует объяснения каждого пункта ответа. Ответы неполные, хотя биологическая ошибка содержится только во втором пункте.

У крупного рогатого скота в соматических клетках 60 хромосом. Определите число хромосом и молекул ДНК в клетках яичников в интерфазе перед началом деления и после деления мейоза I. Объясните, как образуется такое число хромосом и молекул ДНК.

Элементы ответа

1. В интерфазе перед началом деления число молекул ДНК — 120, число хромосом — 60; после мейоза I число хромосом — 30, ДНК — 60.
2. Перед началом деления молекулы ДНК удваиваются, их число увеличивается, а число хромосом не изменяется — 60, каждая хромосома состоит из двух сестринских хроматид.
3. Мейоз I — редукционное деление, поэтому число хромосом и молекул ДНК уменьшается в 2 раза.

Ответ выпускника

1. Перед мейозом I число молекул ДНК удваивается, а число хромосом остается прежним. 2. После первого деления мейоза число хромосом и молекул ДНК становится 30 и 60 соответственно. 3. В результате мейоза I образуются гаплоидные клетки с формулой n2c.

Комментарий. Оценка экспертов – 2 и 3 балла. Ответ верный и представляет собой один из возможных вариантов.

Решение задач по генетике

Задача 1. У дрозофил цвет глаз определяется геном, находящимся в Х-хромосоме (красный цвет доминирует над белым). Ген, отвечающий за форму крыльев находится в аутосоме (нормальная форма крыльев доминирует над укороченной). Самку с белыми глазами и укороченными крыльями скрестили с красноглазым самцом с нормальными крыльями, гомозиготным по этому признаку. Затем провели обратное скрещивание: дигомозиготную (по обоим признакам) самку с красными глазами и нормальными крыльями скрестили с белоглазым самцом с укороченными крыльями. Составьте схему скрещивания, укажите генотипы и фенотипы всех родителей и потомков. Объясните полученное расщепление.

Комментарий. При решении таких задач необходим тщательный анализ условий. В данном случае выпускник может не обратить внимание на положение «сцепление гена окраски глаз», неверно записать генотип самца. Это особенно сложно при иной формулировке задания.

Элементы ответа

Первое скрещивание

1.

♀ XaXabb X ♂ X AY BB
Бел. гл. укор. кр	Кр.гл норм. кр.
G Xab	X AB, YВ
F1 ♀ X AXaBb	♂ X аY Bb
Кр.гл норм. кр	Бел. гл норм. кр

Второе скрещивание

2.

Р ♀ X AX ABB Х ♂ X аY bb
Кр.гл норм. кр	Бел. гл. укор. кр
G X AB	Xab , Yb
X A XaBb	X AY Bb

Все с красными глазами и нормальными крыльями.

Объяснение. По гену глаз, сцепленному с Х-хромосомой, наблюдается разное расщепление, а по гену окраски расщепление не зависит от пола (допускается иная генетическая символика).

Задача 2. У львиного зева красная окраска цветка не полностью доминирует над белой окраской. Гибридные растения имеют розовую окраску. Узкие листья не полностью доминируют над широкими листьями. У гибридов листья имеют среднюю ширину. Какое потомство и в каких отношениях получится от скрещивания красноцветкового растения, имеющего средние по ширине листья, с растением, имеющим розовые цветки и средние листья. Определите генотипы и фенотипы родителей и потомства. Создайте схему скрещивания, используя решетку Пеннета.

Элементы ответа

Схема решения задачи. А — красные цветки, а — белые цветки, В — узкие листья, в — широкие листья.

1.

	Р ♀ ААВв	♂ АаВв
	красные цветки	розовые цветки
	средние листья	средние листья
Гаметы	АВ, Ав	АВ, Ав, аВ, ав

2.

	АВ	АВ	аВ	Ав
АВ	ААВ В	ААВ в	АаВВ	АаВв
Ав	ААВ в	ААвв	АаВв	Аавв

3. F1 1/8 c красными цветками и узкими листьями, 1/4 с красными цветками и средними листьями, 1/8 с красными цветками и широкими листьями, 1/8 с розовыми цветками и узкими листьями, 1/4 с розовыми цветками и средними листьями, 1/8 с розовыми цветками и широкими листьями.

Комментарий. Ответы учеников при неверном выполнении задания сопровождаются следующими ошибками: пишутся генотипы родителей (сразу ставится 0 баллов), не подписываются фенотипы (несмотря на требование условия), не полностью даются соотношения генотипов или фенотипов, не даются объяснения результатов (когда они требуются условием).

Задача 3. Мужчина-дальтоник, имеющий вторую группу крови и гетерозиготный по данному признаку, женится на женщине — носительнице гена дальтонизма, у которой первая группа крови. Составьте схему решения задачи. Определите генотипы родителей, вероятность рождения детей-дальтоников с первой группой крови и генотипы родителей, у которых родятся дети с указанными признаками. Объясните результаты скрещивания.

Элементы ответа

1.

Родители	♂I АI 0Х dY x ♀ I 0 I 0 X D X d
Гаметы	I АХ d , I АY, I0Х d , I0Y	I0 X D, I 0X d

2. F1 ♀ I ⁰ I ⁰Х ^d X ^d девочки с первой группой крови, дальтоники

♂ I ⁰ I ⁰X ^d Y мальчики с первой группой крови, дальтоники

Вероятность рождения мальчиков и девочек с первой группой крови, дальтоников (вместе) 25%.

3. Гены дальтонизма сцеплены с Х-хромосомой. Поэтому патология проявляется только у мальчиков. Наследование происходит в соответствии с Законом независимого наследования признаков (Третий закон Г. Менделя) и наследования, сцепленного с полом.

Задача 4. У человека отсутствие потовых желез определяется рецессивным геном, сцепленным с Х—хромосомой, а низкий голос — аутосомный доминантный признак. Мужчина, имеющий низкий голос (АА) и страдающий отсутствием потовых желез, женится на женщине с высоким голосом и имеющей потовые железы. Составьте схему решения задачи. Определите генотипы родителей, возможные генотипы и фенотипы потомства и вероятность рождения в этой семье мальчиков без потовых желез. Рассмотрите все возможные случаи.

Элементы ответа

Первый вариант

	Р. ♂ ААХРУ Х ♀ ааХрХ р
	Низкий голос и нет потовых желез	Высокий голос и есть потовые железы
Гаметы	АХр , АУ	аХр
	F1 ♂ АаХрУ ,	♀ АаХРХ р
	Низкий голос, есть потовые железы	Низкий голос, есть потовые железы

Вероятность рождения мальчика без потовых желез равна нулю.

Второй вариант

	Р. ♂ ААХРУ Х ♀ ааХрХ р
	Низкий голос, нет потовых желез	Высокий голос, есть потовые железы
Гаметы	АХр , АУ	аХр , ахр

F2 а) АаХ^р У — низкий голос, есть потовые железы. б) АаХ^р Х ^р — низкий голос, есть потовые железы. в) АаХ^рУ — низкий голос, есть потовые железы. г) Аа Х ^р У — низкий голос, нет потовых желез. Вероятность рождения мальчика без потовых желез 25%

Тема: Циклы развития растений

Рассмотрите рисунок жизненного цикла Хламидомонады и укажите названия стадий, обозначенных цифрами 1,2,3. В результате какого деления образовались клетки, обозначенные цифрой 1? Чем представлены гаметофит и спорофит этой зеленой водоросли?

Элементы ответа

1. 1 — гаметы, 2 — зигота, 3 — взрослый организм.
2. Гаметы образуются в результате митотического деления гаметофита.
3. Гаметофит представлен взрослым организмом, спорофит — зиготой.

Комментарий. Так как школьники могут плохо различать споры и гаметы, то имеет смысл найти прием, который поможет им понять последовательность развития водоросли. Например: из зиготы развиваются только споры, а споры образуются только в результате мейоза. Или: гаметы у животных образуются мейозом, а у растений митозом. Нужен жесткий алгоритм при обучении. У задания могут быть варианты.

Ответ выпускника

1. 1 — гаметы, 2 — зигота (спорофит), 3 — взрослая особь. 2. Гаметы всегда образуются мейозом. 3. Гаметофит — представлен клеткой со жгутиками.

Комментарий. Оценка экспертов – 2 балла. Ответ содержит одну ошибку.

Какими способами деления, и в каких органах растения образуются споры мха Кукушкин лен и его гаметы? В результате какого процесса образуется спорофит мха?

Элементы ответа

1. Споры мха Кукушкин лен образуются в результате мейоза из материнских клеток спорангия (коробочки).
2. Гаметы образуются на гаметофитах в антеридиях и архегониях путем митоза.
3. Спорофит образуется в результате оплодотворения яйцеклетки на женском растении мха.

Ответ выпускника

1. Споры мха образуются из материнских клеток мха. 2. Гаметы образуются в половых органах растения. 3. Спорофит — это коробочка, образующаяся на женском растении из зиготы.

Комментарий. Оценка экспертов 1 балл. В первом пункте допущена ошибка (клетки мха, а не спорангия). Во втором пункте отсутствует терминология (антеридии и архегонии). Третий пункт не соответствует вопросу по смыслу: надо назвать процесс, а не структуру. Тем не менее, ответ в первых двух пунктах неполно, но дан.

Какой хромосомный набор характерен для клеток заростка и гамет папоротника? Объясните, из каких исходных клеток и в результате какого деления образуются эти клетки

Элементы ответа

1. Набор хромосом заростка папоротника — n; гамет — n.
2. Заросток развивается из гаплоидной споры путем митоза.
3. Гаметы развиваются на гаплоидном заростке путем митоза.

Ответ выпускника

1. Набор хромосом у заростка гаплоидный. 2. Заросток развивается из гаплоидной споры путем митоза. 3. Гаметы всегда образуются путем мейоза.

Комментарий. Оценка экспертов – 2 балла. Выпускник не понимает, что гаплоидные клетки не могут делиться мейозом и не знает способа образования гамет у растений.

Какие клетки, и каким способом деления, образуются в тычинках покрытосеменных растений? Каким клеткам, и в результате какого деления, дают начало образовавшиеся клетки?

Элементы ответа

1. Из материнских клеток спор пыльника образуются гаплоидные микроспоры.
2. Они образуются путем мейоза.
3. Они дают начало мужским гаметофитам — пыльцевым зернам, образующимся в результате митоза микроспор.

Ответ выпускника № 1

1. В тычинках образуются микроспоры. 2. Они образуются путем митоза, так как клетки тычинок диплоидны. 3. Путем дальнейшего митоза образуются пыльцевые зерна.

Комментарий. Оценка экспертов – 2 балла. Ответ 2 содержит биологическую ошибку, демонстрируя непонимание процесса мейоза.

Ответ выпускника № 2

1. В тычинках образуются микроспоры. 2. Они образуются мейозом. 3. Они дают начало вегетативным и генеративным клеткам, делясь митозом.

Комментарий. Оценка экспертов – 2 и 3 балла. Второй эксперт учел третий ответ как правильный.

Тема: Разнообразие организмов. Растения

Какие процессы обеспечивают транспорт минеральных веществ в растениях? Ответ объясните.

Элементы ответа

1. Во всасывающей зоне корня развивается корневое давление, которое обеспечивает подъем минерального раствора на определенную высоту, благодаря разнице между концентрациями раствора в почве и в растении.
2. Транспирация (присасывающая сила листьев) также поднимает растворы на достаточно большую высоту по сосудам.
3. Поступление растворов в ткани растения обеспечивается также механизмами осмоса и диффузии.

Ответ выпускника № 1

Вода поднимается по растению вверх благодаря корневому давлению и сосущей силе листьев.

Комментарий. Оценки экспертов 1 и 2 балла. Оценку в 1 балл трудно апеллировать, поскольку механизмы процессов не раскрыты.

Ответ выпускника № 2

1. Корневые волоски всасывают растворы из почвы. 2. Это происходит в результате осмоса и диффузии, направленных по градиенту концентрации. 3. Испарение воды листьями также способствует подъему раствора по растению.

Комментарий. Оценка экспертов – 3 балла.

На каком основании заразиху, петров крест и раффлезию относят к растениям? Какой образ жизни они ведут?

Элементы ответа

1. Эти организмы относят к растениям, потому что у них есть цветки и вегетативные органы, характерные для растений.
2. Это растения-паразиты, питающиеся органическими веществами растений-хозяев, к корням которых они присасываются.

Ответ выпускника № 1

1. Это растения, потому что у них есть цветок. 2. Они растут всю жизнь и создают органические вещества из неорганических.

Комментарий. Оценка экспертов – 1 балл. Второй ответ неверен.

Ответ выпускника № 2

1. Заразиха и петров крест — паразиты, имеющие цветок. Про раффлезию не знаю. 2. Наверное, у них нет хлорофилла, и они вынуждены получать пищу из других растений-хозяев.

Комментарий. Оценка экспертов – 2 балла.

Как можно продлить жизнь цветов, поставленных в вазу с водой? Ответ объясните.

Элементы ответа

1. В проводящие сосуды срезанных цветов попадает воздух, преграждающий путь воде.
2. Нужно обрезать часть стеблей под водой, чтобы вытеснить воздух из растения.
3. В некоторых случаях рекомендуют растворить в воде немного аспирина или сахара (1 ч. ложку).

Комментарий. Вариантов ответов достаточно много. Главное, чтобы они соответствовали смыслу вопроса. В основном выпускники указывают: добавить сахар, поместить в отстоявшуюся воду, соблюдать температурный режим. Про правила обрезки вспоминают редко.

В клетках растений имеются хлоропласты с гранами и тилакоидами, митохондрии с кристами, ЭПС. Что общего в строении этих структур и каково биологическое значение этого сходства?

Элементы ответа

1. Перечисленные органоиды образованы складками плазматических мембран.
2. Эти складки увеличивают рабочую поверхность органоида и клетки в целом.

Ответ выпускника № 1

1. Это мембранные органоиды. 2. Благодаря мембранам активность органоида повышается.

Комментарий. Оценка экспертов – 1 балл. Нет объяснения повышению активности органоида.

Ответ выпускника № 2

1. В каждом из этих органоидов идет синтез веществ. 2. В хлоропластах синтезируется глюкоза, в митохондриях – АТФ, на шероховатой ЭПС – белки.

Комментарий. Оценка экспертов – 0 баллов. Несоответствие ответа вопросу не позволяет оценить ответ положительно.

---

#ADVERTISING_INSERT#

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Биология — самая быстро развивающаяся наука во второй половине ХХ и ХХI веке. Связано это, в первую очередь, с появлением нового ее раздела — молекулярной биологии, подоплекой возникновения которой, в свою очередь, стало стремительное развитие физики, химии и физико-химических методов. Я расскажу о важнейших (на мой взгляд) методах молекулярной биологии, с помощью которых были сделаны многие открытия, известные не только в узких научных кругах, но и среди широкой публики. Они принесли множество Нобелевских премий как тем, кто их открыл, так и тем, кто их использовал. Многие из них применяются не только в биологии, но и в других областях: медицине, криминалистике, археологии.

Введение

Строение ДНК

Началом молекулярной биологии принято считать открытие структуры ДНК (рис. 1) в 1953 году Джеймсом Уотсоном и Френсисом Криком, за что они (совместно с Морисом Уилкинсом) в 1962 году получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине [1], [2]. Они выяснили, что молекула ДНК представляет из себя две противоположно направленные цепочки полинуклеотидов, закрученных вокруг общей оси в двойную спираль, причем друг напротив друга в спирали всегда стоят определенные азотистые основания: напротив гуанина (Г или G) — цитозин (Ц или C), а напротив аденина (А) — тимин (Т) (рис. 1). Это называют правилом комплементарости: цепи удерживаются вместе за счет водородных связей, возникающих между нуклеотидами. Водородная связь гораздо слабее ковалентной, с помощью которой нуклеотидные остатки соединяются между собой в одной цепи ДНК, формируя так называемый сахаро-фосфатный остов. Его так называют, поскольку в нем остатки сахара (дезоксирибозы) в нуклеотидах связаны друг с другом через остатки ортофосфорной кислоты — фосфаты. Концы обеих цепей не равноценны: по порядковому номеру атома углерода в остатке сахара один из них называют 3´, а другой — 5´. Синтез ДНК (как и РНК) в природе, как правило, идет от 5´ к 3´-концу.

Возможно, следовало бы начать отсчет с экспериментов Бидла, Татума, Ледерберга, но это дело вкуса. — Ред.

Однако ДНК не обязательно бывает двуцепочечной — иногда встречаются и одноцепочечные молекулы (например, в геномах некоторых вирусов). Это очень важно, поскольку, как будет рассказано ниже, двуцепочечные молекулы могут денатурировать на одноцепочечные, и, наоборот, одноцепочечные образовывать двуцепочечные.

Строение РНК аналогично (хотя обычно она состоит из одной цепи и часто образует комплементарные взаимодействия между участками одной молекулы), только вместо тимина в ее состав входит урацил, а вместо дезоксирибозы — рибоза. Подробнее обо всем этом написано в учебниках по молекулярной биологии [3].

Центральная догма молекулярной биологии

Я кратко напомню так называемую центральную догму молекулярной биологии, в первоначальном виде сформулированную Фрэнсисом Криком [4]. В общем случае она гласит, что генетическая информация при реализации передается от нуклеиновых кислот к белку, но не наоборот. А точнее, возможно передача ДНК → ДНК (репликация), ДНК → РНК (транскрипция) и РНК → белок (трансляция). Так же существуют значительно реже реализуемые пути, свойственные некоторым вирусам: РНК → ДНК (обратная транскрипция) и РНК → РНК (репликация РНК). Также напомню, что белки состоят из аминокислотных остатков, последовательность которых закодирована в генетическом коде организма: три нуклеотида (их называют кодон, или триплет) кодируют одну аминокислоту, причем одну и ту же аминокислоту может кодировать несколько кодонов.

Во второй половине XX века получили развитие технологии рекомбинантной ДНК (то есть, методы манипуляции ДНК, позволяющие различными способами изменять последовательность и состав нуклеотидов в молекуле). Именно на их основе происходит развитие всех молекулярно-биологических методов и поныне, хотя они стали значительно сложнее, как идейно, так и технологически. Именно молекулярная биология вызвала такой бурный рост количества биологической информации за последние полвека.

Я расскажу о методах манипуляции и изучения ДНК и РНК, совсем немного коснусь белков, поскольку в основном методы, связанные с ними, ближе к биохимии, чем к молекулярной биологии (хотя грань между ними в последнее время стала очень расплывчатой).

Разрезание и сшивание

Рестрикционные эндонуклеазы

Одним из первых и важнейших из шагов молекулярной биологии стала возможность разрезать молекулы ДНК, причем в строго определенных местах [3]. Этот метод был изобретен при изучении в 1950—1970-е годы такого феномена: некоторые виды бактерий при добавлении в среду чужеродной ДНК разрушали ее, в то время, как их собственная ДНК оставалась невредимой. Оказалось, что они для этого используют ферменты, позднее названные рестрикционными нуклеазами или рестриктазами. Существует множество видов рестриктаз: к 2007-му году их было известно более 3000 [5]. Важным свойством каждого подобного фермента является его способность разрезать строго определенную — целевую — последовательность нуклеотидов ДНК (рис. 2). Рестриктазы не воздействуют на собственную ДНК клетки, поскольку нуклеотиды в целевых последовательностях модифицированы так, что рестриктаза не может с ними работать. (Правда, иногда, наоборот, они могут разрезать только модифицированные последовательности — для борьбы с теми, кто модифицирует ДНК, защищаясь от вышеописанных рестриктаз.) Из-за того, что целевые последовательности бывают различной длины, частота встречаемости их в молекулах ДНК варьирует: чем длиннее необходимый фрагмент, тем меньше вероятность его появления. Соответственно, образующиеся при обработке различными рестриктазами фрагменты ДНК будут иметь различную длину.

Новые эндонуклеазы продолжают открывать и по сей день. Многие из них до сих пор не клонированы, то есть, не известны гены, которые их кодируют, и в качестве «фермента» используют некую очищенную фракцию белков, обладающую нужной каталитической активностью. Новосибирская компания СибЭнзим долгое время успешно соревновалась с компанией New England Biolabs — признанным во всем мире лидером по поставке рестритаз (то есть предлагала такое же или большее различных рестриктаз, некоторые из которых весьма экзотичны). — Ред.

За выделение первой рестриктазы, изучение ее свойств и первое применение для картирования хромосом Вернер Арбер (Werner Arber), Дэн Натанс (Dan Nathans) и Гамильтон Смит (Hamilton Smith) в 1978 году получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

ДНК-лигазы

Для создания новых молекул ДНК, разумеется, кроме разрезания, необходима еще и возможность сшивания двух цепей. Это делают с помощью ферментов, называемых ДНК-лигазами, которые сшивают сахаро-фосфатный остов двух цепей ДНК. Поскольку по химическому строению ДНК не отличается у разных организмов, можно сшивать ДНК из любых источников, и клетка не сможет отличить полученную молекулу от своей собственной ДНК.

Разделение молекул ДНК: электрофорез в геле

Часто приходится иметь дело со смесью молекул ДНК разной длины. Например, при обработке химически выделенной из организма ДНК рестриктазами как раз получится смесь фрагментов ДНК, причем их длины будут различаться.

Поскольку любая молекула ДНК в водном растворе отрицательно заряжена, появляется возможность разделить смесь фрагментов ДНК различных размеров по их длине с помощью электрофореза  [3], [6]. ДНК помещают в гель (обычно, агарозный для относительно длинных и сильно отличающихся молекул или полиакриламидный для электрофореза с высоким разрешением), который помещают в постоянное электрическое поле. Из-за этого молекулы ДНК будут двигаться к положительному электроду (аноду), причем их скорости будут зависеть от длины молекулы: чем она длиннее, тем сильнее ей мешает двигаться гель и, соответственно, тем ниже скорость. После электрофореза смеси фрагментов разных длин в геле образуют полосы, соответствующие фрагментам одной и той же длины. С помощью маркеров (смесей фрагментов ДНК известных длин) можно установить длину молекул в образце (рис. 3).

Визуализовать результаты фореза можно двумя способами. Первый, наиболее часто используемый в последнее время — добавление в гель веществ, флуоресцирующих в присутствии ДНК (традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества). Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков (рис. 4). Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК. В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения (этот метод визуализации называют авторадиографией).

Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез, который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем (обычно полиакриламидным). Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид. Об одном из важных приложений такого метода читайте ниже в описании метода секвенирования ДНК по Сэнгеру.

Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг

С помощью электрофореза можно узнать размер молекул ДНК в растворе, однако он ничего не скажет о последовательности нуклеотидов в них. С помощью гибридизации ДНК можно понять, какая из полос содержит фрагмент со строго определенной последовательностью. Гибридизация ДНК основана на образовании водородных связей между двумя цепями ДНК, приводящем к их соединению [3], [7].

Сначала необходимо синтезировать ДНК-зонд, комплементарный той последовательности, которую мы ищем. Он обычно представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 10–1000 нуклеотидов. Из-за комплементарности зонд свяжется с необходимой последовательностью, а за счет флуоресцентной метки или радиоизотопов, встроенных в зонд, результаты можно увидеть.

Для этого используют процедуру, называемую Саузерн-блоттинг или перенос по Саузерну, названную по имени ученого, ее изобретшего (Edwin Southern). Первоначально смесь фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза. На гель сверху кладут лист нитроцеллюлозы или нейлона, и разделенные фрагменты ДНК переносятся на него за счет блоттинга: гель лежит на губке в ванночке с раствором щелочи, который просачивается через гель и нитроцеллюлозу за счет капиллярного эффекта от бумажных полотенец, сложенных сверху. Во время просачивания щелочь вызывает денатурацию ДНК, и на поверхность пластины нитроцеллюлозы переносятся и закрепляются там уже одноцепочечные фрагменты. Лист нитроцеллюлозы аккуратно снимают с геля и обрабатывают радиоактивно меченной ДНК-пробой, специфичной к необходимой последовательности ДНК. Лист нитроцеллюлозы тщательно отмывают, чтобы на нем остались только те молекулы пробы, которые гибридизовались с ДНК на нитроцеллюлозе. После авторадиографии ДНК, с которой гибридизовался зонд, будет видна как полосы на фотопластинке (рис. 5).

Адаптация этой методики для определения специфических последовательностей РНК называется, в противоположность Саузерн-блоттингу, норзерн-блоттингом (northern blotting: southern по-английски означает «южный», а northern — «северный»). В этом случае проводят электрофорез в геле с молекулами мРНК, а в качестве зонда выбирают одноцепочечную молекулу ДНК или РНК.

Клонирование ДНК

Мы уже знаем, каким образом можно разрезать геном на части (а их сшивать с произвольными молекулами ДНК), разделять полученные фрагменты по длине и с помощью гибридизации выбрать необходимый. Теперь настало время узнать, как, скомбинировав эти методы, мы можем клонировать участок генома (например, определенный ген). В геноме любой ген занимает крайне маленькую длину (по сравнению со всей ДНК клетки). Клонирование ДНК буквально означает создание большого числа копий определенного ее фрагмента. Именно за счет этой амплификации мы получаем возможность выделить участок ДНК и получить его в достаточном для изучения количестве.

Каким образом разделить фрагменты ДНК по длине и идентифицировать нужный — было рассказано выше. Теперь надо понять, каким образом можно копировать необходимый нам фрагмент. Существует два основных метода: использование быстро делящихся организмов (обычно бактерий Escherichia coli — кишечной палочки — или дрожжей Saccharomyces serevisiae) или проделать аналогичный процесс, но in vitro с помощью полимеразной цепной реакции.

Репликация в бактериях

Поскольку при каждом клеточном делении бактерии (как и любые другие клетки, не считая предшественников половых клеток) удваивают свою ДНК, это можно использовать для умножения количества необходимой нам ДНК [3]. Для того, чтобы внедрить наш фрагмент ДНК в бактерию, необходимо «вшить» его в специальный вектор, в качестве которого обычно используют бактериальную плазмиду (небольшую — относительно бактериальной хромосомы — кольцевую молекулу ДНК, реплицирующуюся отдельно от хромосомы). У бактерий «дикого типа» часто встречаются подобные структуры: они часто переносятся «горизонтально» между разными штаммами или даже видами бактерий. Чаще всего в них содержатся гены устойчивости к антибиотикам (именно из-за этого свойства их и открыли) или бактериофагам, а также гены, позволяющие клетке использовать более разнообразный субстрат. (Иногда же они «эгоистичны» и не несут никаких функций.) Именно такие плазмиды обычно и используют в молекулярно-генетических исследованиях. В плазмидах обязательно содержится точка начала репликации (последовательность, с которой начинается репликация молекулы), целевая последовательность рестриктазы и ген, позволяющий отобрать те клетки, которые обладают этой плазмидой (обычно, это гены устойчивости к какому-нибудь антибиотику). В некоторых случаях (например, при изучении очень больших фрагментов ДНК) используют не плазмиду, а искусственную бактериальную хромосому.

В плазмиду с помощью рестриктаз и лигаз встраивают необходимый фрагмент ДНК, после чего добавляют ее в культуру бактерий при специальных условиях, обеспечивающих трансформацию — процесс активного захвата бактерией ДНК из внешней среды (рис. 6). После этого проводят отбор бактерий, трансформация которых прошла успешно, добавляя соответствующий гену в плазмиде антибиотик: в живых остаются только клетки, несущие ген устойчивости (а, следовательно, и плазмиду). Далее, после роста культуры клеток, из нее выделяют плазмиды, а из них с помощью рестриктаз выделяют «наш» фрагмент ДНК (или использую плазмиду целиком). Если же ген вставили в плазмиду для того, чтобы получить его белковый продукт, необходимо обеспечить культуре условия для роста, а потом просто выделить требуемый белок.

На этом месте сразу же должен возникать вопрос: как же все это возможно было использовать до того, когда были расшифрованы геномы, да и чтение последовательности ДНК было еще дорогим и малораспространенным? Положим, с помощью рестрикции и клонирования полученных фрагментов мы получим библиотеку ДНК, то есть набор бактерий, несущих различные плазмиды, содержащие суммарно весь геном (или заметную его часть). Но каким образом мы сможем понять, в каком из фрагментов содержится необходимый ген? Для этого использовали метод гибридизации. Сначала необходимо было выделить белок нужного гена. После чего отсеквенировать его фрагмент, обратить генетический код и получить последовательность нуклеотидов (конечно, из-за вырожденности генетического кода приходилось пробовать много различных вариантов). В соответствии с ней химически синтезировали короткую молекулу ДНК, которую и использовали в качестве зонда для гибридизации.

Но в некоторых случаях этот метод давал сбои — например, так произошло с фактором свертывания крови VIII. Этот белок участвует в свертывании крови , и нарушения в его функциональности являются причиной одного из самых распространенных генетических заболеваний — гемофилии А. Раньше для лечения приходилось выделять этот белок из большого числа организмов, потому что не удавалось клонировать его для производства бактериями. Связано это было с тем, что его длина составляет около 180000 пар нуклеотидов, и он содержит много интронов (некодирующих фрагментов между кодирующими) — неудивительно, что ни в одну плазмиду этот ген не попал целиком.

О механизмах свертывания крови см. «Как работает свертывание крови?». — Ред.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция — молекулярно-биологический метод, позволяющий добиться колоссального (до 10¹² раз) увеличения числа копий определенного фрагмента ДНК in vitro [3], [9]. Она была изобретена Кэри Муллисом (Kary Mullis) в 1983 году, за что в 1993 году он получил Нобелевскую премию по химии (совместно с М. Смитом). (См. также: «Кари Маллис, изобретатель ПЦР» [10].)

Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. При этом происходит копирование только того участка ДНК, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от репликации ДНК в клетках живых организмов, с помощью ПЦР амплифицируют сравнительно короткие участки ДНК (обычно, не более 3000 пар нуклеотидов, однако есть методы позволяющие «поднимать» до 20 тысяч пар нуклеотидов — так называемый Long Range PCR).

Фактически, ПЦР является искусственной многократной репликацией фрагмента ДНК (рис. 7). ДНК-полимеразы так устроены, что не могут синтезировать новую ДНК, просто имея в наличии матрицу и мономеры. Для этого необходима еще и затравка (праймер), с которого они начинают синтез. Праймер — это короткий одноцепочечный фрагмент нуклеиновой кислоты, комплементарный ДНК-матрице. При репликации в клетке такие праймеры синтезируются специальным ферментом праймазой и являются молекулами РНК, которые позже заменяются на ДНК. Однако в ПЦР используют искусственно синтезированные молекулы ДНК, поскольку в этом случае не нужна стадия удаления РНК и синтеза на их месте ДНК. В ПЦР праймеры ограничивают амплифицируемый участок с обеих сторон.

Итак, пора объяснить, как же ПЦР работает. Изначально в реакционной смеси находятся: ДНК-матрица, праймеры, ДНК-полимераза, свободные нуклеозиды (будущие «буквы» в новосинтезированной ДНК), а также некоторые другие вещества, улучшающие работу полимеразы (их добавляют в специальные буферы, используемые в реакции).

Чтобы синтезировать ДНК, комплементарную матрице, необходимо, чтобы один из праймеров образовал с ней водородные связи (как говорят, «отжегся» на ней). Но ведь матрица уже образует их со второй цепью! Значит, сначала необходимо расплавить ДНК, — то есть разрушить водородные связи. Делают это с помощью простого нагревания (до ≈95 °С) — стадия, называемая денатурацией. Но теперь и праймеры из-за высокой температуры не могут отжечься на матрице! Тогда температуру понижают (50–65 °С), праймеры отжигаются, после чего температуру немного поднимают (до оптимума работы полимеразы, обычно, около 72 °С). И тогда полимераза начинает синтезировать комплементарные матрице цепи ДНК — это называют элонгацией (рис . 8). После одного такого цикла количество копий необходимых фрагментов удвоилось. Однако ничто не мешает повторить это еще раз. И не один, а несколько десятков раз! И с каждым повтором количество копий нашего фрагмента ДНК будет удваиваться, ведь новосинтезированные молекулы тоже будут служить матрицами (рис. 9)! (На самом деле эффективность ПЦР редко настолько высока, что количество копий именно удваивается, но в идеале это так, да и реальные числа часто бывают близки к этому.)

Увидеть результаты ПЦР очень просто: достаточно провести электрофорез реакционной смеси после ПЦР, и будет видна яркая полоса с полученными копиями.

Раньше полимеразу, инактивирующуюся при нагревании с каждым циклом, приходилось все время добавлять, но вскоре было предложено использовать термостабильную полимеразу из термофильных бактерий, которая выдерживает такой нагрев, что сильно упростило проведение ПЦР (чаще всего используют Taq-полимеразу из бактерии Thermus aquaticus [11]).

Чтобы избежать сильного испарения воды из реакционной смеси, в нее добавляют масло, покрывающее ее сверху, и/или используют нагревающуюся крышку термоциклера — прибора, в котором проводят ПЦР. Он быстро меняет температуру пробирок, и их не приходится постоянно перекладывать из одного термостата в другой. Для предотвращения неспецифического синтеза еще до нагрева и собственно начала циклов, часто использую ПЦР с «горячим стартом»: вся ДНК и полимераза разделяются между собой парафиновой прослойкой, которая плавится при высокой температуре и дает им взаимодействовать уже в правильных условиях. Иногда же используют модифицированные полимеразы, которые не работают при низкой температуре.

Можно еще много говорить о различных тонкостях ПЦР, но важнее всего сказать об альтернативных классическому форезу методах определения результатов. Например, довольно очевидным вариантом является добавление в реакционную пробирку перед началом реакции веществ, флуоресцирующих в присутствии ДНК. Тогда, сравнив изначальную флуоресценцию с конечной, можно увидеть, синтезировалось ли значительное количество ДНК или нет. Но этот способ не специфичен: мы никак не сможем определить, синтезировался ли необходимый фрагмент, или это какие-то праймеры слиплись и достроились до непредсказуемых последовательностей.

Наиболее интересным вариантом является ПЦР «в реальном времени» («real-time PCR») . Существует несколько реализаций этого метода, но идея везде одна и та же: можно прямо в ходе реакции наблюдать за накоплением продуктов ПЦР (по флуоресценции). Соответственно, для проведения ПЦР «в реальном времени» нужен специальный прибор, способный возбуждать и считывать флуоресценцию в каждой пробирке. Самое простое решение — добавить в пробирку те же самые вещества, которые флуоресцируют в присутствии ДНК, однако минусы такого метода уже были описаны выше.

Строго это называется «ПЦР с регистрацией флуоресценции в режиме реального времени» или «количественная ПЦР». — Ред.

Самой популярной реализацией такого подхода является метод выщепления флуорофора за счет разрушения зонда (TaqMan Assay; рис. 10). В этом случае в реакционной смеси должен присутствовать еще один компонент — специальный одноцепочечный ДНК-зонд: молекула ДНК, комплементарная последовательности амплифицируемого фрагмента, расположенной между праймерами. При этом к одному его концу должен быть химически приделан флуорофор (флуоресцирующая молекула), а к другому — гаситель (молекула, поглощающая энергию флуорофора и «гасящая» флуоресценцию). Когда такой зонд находится в растворе или комплементарно связан с целевой последовательностью, флуорофор и гаситель находятся относительно недалеко друг от друга, и флуоресценции не наблюдается. Однако за счет 3´-экзонуклеазной активности, которой обладает Taq-полимераза (то есть она расщепляет ДНК, на которую «натыкается» в ходе синтеза, и на ее месте синтезирует новую), зонд при синтезе второй цепи разрушается, флуорофор и гаситель за счет диффузии удаляются друг от друга, и появляется флуоресценция.

Поскольку число копий в ходе ПЦР растет экспоненциально, так же растет и флуоресценция. Однако это продолжается недолго, поскольку в какой-то момент эффективность реакции начинает падать из-за постепенной инактивации полимеразы, нехватки каких-то компонентов и т. п. (рис. 11). Анализируя графики роста флуоресценции, можно много понять о протекании ПЦР, но, самое важное, можно узнать, сколько ДНК-матриц было изначально: это так называемая количественная ПЦР (quantitative PCR, qPCR).

Все варианты применения ПЦР в науке невозможно перечислить. Выделение фрагмента ДНК, секвенирование, мутагенез… ПЦР — один из самых востребованных для ненаучных целей метод (видео 1). Он широко применяется в медицине для ранней диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, определения отцовства, в расследованиях для установления личности и для многого другого.

Естественные клеточные процессы in vitro

Все основные молекулярно-биологические процессы могут быть легко проведены in vitro (то есть, в пробирке). Пример приведен выше: ПЦР — это аналог репликации ДНК. Для этого достаточно просто смешать необходимые реагенты в подходящих условиях: для транскрипции нужны ДНК-матрица, РНК-полимераза и рибонуклеотиды, для трансляции — мРНК, субъединицы рибосом и аминокислоты, для обратной транскрипции — РНК-матрица, обратная транскриптаза ( она же ревертаза) и дезоксирибонуклеотиды. Эти методы широко применяются в различных областях биологии, когда необходимо, например, получить чистую РНК определенного гена. В этом случае нужно сначала провести обратную транскрипцию его (гена) мРНК, с помощью ПЦР амплифицировать ее, а затем с помощью in vitro-транскрипции получить много мРНК. Первая стадия необходима из-за того, что перед образованием зрелой мРНК в клетке проходит сплайсинг и процессинг РНК (у эукариот; у бактерий в этом смысле все проще) — подготовка к работе матрицей для синтеза белка. Иногда этого удается избежать, если вся кодирующая последовательность гена расположена в одном экзоне.

Секвенирование ДНК

Можно сказать, важнейшие методы манипуляции с ДНК уже описаны. Следующий этап  — определение собственно нуклеотидной последовательности цепи в молекуле — секвенирование. Определение нуклеотидной последовательности ДНК крайне важно для множества фундаментальных и прикладных задач. Особое место оно занимает в науке: для анализа результатов секвенирования геномов была, фактически, создана новая наука — биоинформатика. Секвенированием сейчас пользуются молекулярные биологи, генетики, биохимики, микробиологи, ботаники и зоологи, и, конечно же, эволюционисты: практически вся современная систематика основана на его результатах. Секвенирование широко применяется в медицине как метод поиска наследственных заболеваний и изучения инфекций. (См., например, «Уточнение „родословной“ членистоногих» и «Скверный анекдот: негр, китаец и Крейг Вентер…». — Ред.)

На самом деле хронологически методы изобретались совсем в другом порядке. Например, секвенирование по Сэнгеру было разработано в 1977 году, а ПЦР, как говорилось выше, только в 1983-м.

Существует множество различных методик секвенирования, но все методы можно разделить на две категории: «классические» и нового поколения. Сейчас используется фактически только один «классический» метод — секвенирование по Сэнгеру , или метод терминаторов. По сравнению с новыми методами, у него есть важное преимущество: длина прочтения, то есть количество нуклеотидов в последовательности, которое можно получить за один раз, у него выше — до 1000 нуклеотидов [12]. В то же время у самого «хорошего» в этом плане «нового» метода секвенирования — 454-, или пиросеквенирования [13] — этот параметр не превышает 500 нуклеотидов . Именно длина прочтения ограничивает возможности новых методов: оказывается крайне сложно «собрать» целый геном из фрагментов размером в несколько десятков нуклеотидов. Как минимум, для этого требуются суперкомпьютеры, а некоторые места в геноме разрешить оказывается просто невозможно, если они содержат высокоповторяющиеся последовательности. В таком случае может помочь сравнение полученных фрагментов с уже имеющимся целым геномом, но таким образом невозможно прочесть геном организма впервые (de novo). (См. также: «Код жизни: прочесть не значит понять». — Ред.)

Английский биохимик и корифей молекулярной биологии, дважды лауреат Нобелевской премии по химии: за определение аминокислотной последовательности инсулина (1955 г.) и за разработку метода секвенирования ДНК (1980 г.). — Ред.

Есть метод нового поколения, позволяющий читать несколько тысяч пн, но с большими ошибками (Pacific Biosciences). 454/Roche сегодня могут читать и больше 500 пн; то же самое уже может и молодое «полупроводниковое секвенирование». — Ред.

Оба упомянутых выше метода секвенирования уже достаточно подробно описаны на «биомолекуле» [13]: очень советую ознакомиться. Я же для примера расскажу про другой распространенный быстрый и дешевый метод (в расчете на один прочитанный нуклеотид) — метод, реализованный в секвенаторах Illumina (видео 2). Основной его недостаток — чтение фрагментов очень короткой длины, не больше 100 нуклеотидов, и вытекающая отсюда сложность прочтения геном «с нуля» [14].

В этом методе можно выделить три стадии: подготовку библиотеки фрагментов (1), создание кластеров (2) и собственно секвенирование (3).

1. Сначала создается библиотека фрагментов ДНК из секвенируемого генома (или любого другого источника ДНК). ДНК с помощью ультразвука или специального фермента расщепляется на произвольные фрагменты длиной в несколько сотен нуклеотидов, из которых выбираются обладающие заданной длиной (выбирается экспериментатором). После этого к ним с двух концов ковалентно присоединяются различные адаптерные последовательности (рис. 12: 1);



2. Этот раствор поступает на специальный микрочип с «пришитыми» к нему фрагментами ДНК, комплементарными адаптерным последовательностям, — праймерами. Там участки геномной ДНК прикрепляются с помощью адаптерных последовательностей к молекулам ДНК на чипе. С помощью ДНК-полимеразы у всех таких фрагментов достраивается вторая комплементарная цепь, которая будет уже ковалентно связана с праймером. Она случайно изгибается, и в какой-то момент попадет на праймер, комплементарный ее адаптерной последовательности. Они свяжутся, и снова достроится вторая цепь. Это повторяют несколько раз, после чего один из типов праймеров отрезают от молекулы ДНК, чтобы в образовавшемся кластере остались только одинаковые цепи (рис. 12: 2–6). Всего на чипе образуются сотни миллионов таких кластеров;
3. Собственно секвенирование. К кластерам добавляют праймеры, комплементарные одной из адаптерных последовательностей, с которой они связываются. Затем добавляют ДНК-полимеразу и специально модифицированные нуклеотиды с прикрепленным к ним флуорофором (разным у разных типов нуклеотидов), синтез после которых заблокирован. Они присоединяются к молекулам ДНК в соответствии с правилом комплементарности. Затем камера сканирует, какой флуорофор появился в каждом кластере по цвету свечения в лазере, и компьютер запоминает расположение кластеров. По этому определяется, какой нуклеотид встроился в цепь. После этого отщепляются флуорофоры от всех нуклеотидов, и дальнейший синтез цепи разблокируется.
   Все повторяется снова: добавляются нуклеотиды, чип сканируется, чтобы определить, какой нуклеотид присоединился к какому кластеру и т.п. (рис. 13). Таким образом секвенируют до 100 нуклеотидов в каждом кластере, а всего их сотни миллионов — в итоге это десятки миллиардов пар нуклеотидов.

Было уже довольно много сказано про методы работы с нуклеиновыми кислотами и их изучения. Пришло время узнать, каким образом можно выяснить, как же клетка работает — в частности, попытаться определить функцию гена и белка, который он кодирует.

In vitro-мутагенез

Для изучения функции белка очень важно научиться вносить в него мутации. Например, имея организм с неработающим ферментом, можно по биохимическим отличиям понять, что делает нормальный белок. Существуют разные способы создать полностью неработающий ген (как произвольный из всего генома, так и совершенно конкретный — тогда это называется нокаутом этого гена). Один из таких способов — вставка какого-то фрагмента ДНК в геном: если эта вставка придется на ген, то он (точнее, скорее всего, белок, который он кодирует) перестанет нормально функционировать.

Однако существуют способы очень точного изменения последовательности гена и, соответственно, белка. Про один из таких методов — сайт-специфичный мутагенез — я и расскажу. Суть его заключается в изменении конкретного (обычно одного) нуклеотида в последовательности. Для его использования сначала необходимо клонировать этот ген в плазмиде. После этого нужно провести как бы ПЦР с одним праймером. Причем этот праймер должен как раз включать в себя последовательность, которую мы хотим изменить — уже в нужном нам виде. Например, на рис. 14 вместо буквы А, которая должна была бы стоять напротив Т в родительской цепи, в праймере стоит Ц. После синтеза второй цепи ДНК плазмиды, содержащей праймер, в нее будет внесена мутация — А заменится на Ц. Такие плазмиды вводятся в клетки, в которых при делении две цепи окажутся в разных дочерних клетках. Таким образом, в половине клеток-потомков будет изначальный вариант плазмиды, а в половине — мутантный. Тогда, соответственно, половина клеток будет производить нормальный белок, кодируемый этим геном, а половина — мутантный. В случае, изображенном на рис. 14, в нем вместо одной аминокислоты (аспарагина) будет стоять другая (аланин). По аналогии можно вносить случайные мутации с помощью специальной ДНК-полимеразы, вносящей повышенное число ошибок.

Системная РНК-интерференция

РНК-интерференция — недавно (менее 20 лет назад) открытый феномен подавления экспрессии генов в присутствии определенных коротких фрагментов РНК. За открытие и изучение этого явления Эндрю Файер (Andrew Fire) и Крейг Мелло (Craig Mello) получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2006 году. Биомолекула уже достаточно писала про РНК-интерференцию: «Обо всех РНК на свете, больших и малых» [15], я же расскажу о так называемой системной РНК-интерференции у «модельной» нематоды C. elegans, — то есть, об отключении гена во всех (почти) клетках этого червя.

Такой поразительный эффект достигается с помощью введения в клетку двуцепочечных молекул РНК (дцРНК), одна из цепей в каждой из которых комплементарна участку мРНК «выключаемого» гена. Это открывает поразительные возможности для изучения функций генов. Раньше для отключения генов приходилось создавать «нокаутных» животных (что ученые все равно вынуждены делать, например, с мышами — см. «Нобелевскую премию по физиологии и медицине вручили за технологию нокаутирования мышей». — Ред.), у которых изучаемый ген в принципе отсутствует в геноме. Однако создание нокаутов достаточно сложно, а обратно включить ген у таких организмов уже невозможно. С помощью РНК-интерференции отключить ген очень легко, — так же, как и включить, перестав водить в организм соответствующие дцРНК [16].

Существует три основных способа введения дцРНК в организм. Самый очевидный — впрыскивание в животное их раствора. Пользуются также «вымачиванием» нематод в растворе РНК. Однако оказалось, что можно делать все гораздо проще: скармливать нематодам эти молекулы! Причем особенно удобно то, что это так же замечательно работает, если нематод кормить бактериями (E. coli), синтезирующими эти дцРНК (рис. 15) [17].

В принципе то, что молекулы РНК из кишечника распространяются практически по всем тканям, довольно удивительно. Известно, что за попадание молекул РНК в клетки кишечника отвечает белковый канал sid-1 [18], [19]. Однако каким образом РНК распространяются по организму червя, достоверно не известно, — скорее всего, с участием белка rsd-8 [16] Интересно, что все известные белки, принимающие участие в системной РНК-интерференции у C. elegans, имеются и у человека, однако такую эффективную систему искусственного подавления активности генов на системном уровне у человека наблюдать не удается. Если бы была возможность использовать системную РНК-интерференцию у человека, это могло бы стать методом борьбы с огромным набором заболеваний, от простуды до рака .

К слову, использование РНК-интерференции именно на культуре клеток человека позволило выявить, что многие гены человека способствуют развитию вируса гриппа: «Молекулярное двурушничество: гены человека работают на вирус гриппа». — Ред.

Изучение экспрессии генов: ДНК-микрочипы

При изучении функции гена очень важно узнать, когда и в каких тканях организма он работает (экспрессируется), а также вместе с какими другими генами. Если требуется узнать это про небольшое число генов и тканей, то можно это сделать очень просто: выделить РНК из ткани, провести обратную транскрипцию (то есть, синтезировать кДНК — комплементарную ДНК) и затем, провести количественную ПЦР. В зависимости от того, прошла ли ПЦР, мы узнаем, имеется ли мРНК исследуемого гена в ткани.

Однако если необходимо проделать то же самое для множества тканей и многих генов, то эта методика становится очень долгой и затратной. В таком случае используют ДНК-микрочипы [3]. Это небольшие пластинки, на которые нанесены и прикреплены молекулы ДНК, комплементарные РНК изучаемых генов, причем заранее известно, где на них (пластинках) какая молекула расположена. Одним из способов создания чипа является синтез молекул ДНК прямо на нем с помощью робота.

Чтобы изучать экспрессию генов с помощью чипов, необходимо также синтезировать их кДНК и пометить ее флуоресцентным красителем (не разделяя кДНК разных генов). Такую смесь наносят на микрочип, добиваясь, чтобы кДНК гибридизовалась с молекулами ДНК на чипе. После этого смотрят, где наблюдается флуоресценция и сравнивают это с расположением молекул ДНК на чипе. Если место флуоресценции совпадает с положением молекулы ДНК, то в данной ткани этот ген экспрессирован. Кроме того, пометив кДНК из разных тканей разными красителями, можно изучать экспрессию сразу нескольких (обычно все-таки не больше 2) тканей на одном чипе: по цвету флуоресценции можно определить, в какой из тканей он экспрессирован (если сразу в нескольких — получится смешанный цвет) (рис. 16).

Однако в последнее время все чаще вместо чипов используют массовое секвенирование всей кДНК из ткани (создание так называемых транскриптомов), что сильно упростилось из-за развития методов секвенирования. Это оказывается дешевле и эффективнее, поскольку знание полных последовательностей всех мРНК дает больше информации, чем просто сам факт их наличия или отсутствия.

Мы рассмотрели основные методы молекулярной биологии. Надеюсь, что вам стало немного понятнее, каким образом делаются молекулярно-биологические исследования, за что дают Нобелевские премии, и как они могут помочь в некоторых прикладных задачах. Но, более всего, я надеюсь, что вы тоже увидели красоту идей, лежащих в их основе, и, возможно, вам захотелось узнать о каких-то из этих методик подробнее.

1. Нобелевские лауреаты: Дж. Уотсон, Ф. Крик, М. Уилкинс;
2. Уотсон Дж.Д. Двойная спираль. Воспоминания об открытии структуры ДНК. М.: Мир, 1969;
3. Bruce Alberts et al. Essential cell biology (3^rd ed.). 2009;
4. Википедия: «Центральная догма молекулярной биологии»;
5. Roberts RJ., Vincze T., Posfai J., Macelis D. (2007). REBASE — enzymes and genes for DNA restriction and modification. Nucleic Acids Res. 38, D234–D236;
6. Википедия: Gel electrophoresis of nucleic acids (англ.);
7. Википедия: Southern blot (англ.);
8. Жимулев И.Ф. Лекции для студентов 3-го курса по общей и молекулярной генетике (гл. 7);
9. Ребриков Д.В. ПЦР «в реальном времени». М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009;
10. Телков М.В. (2006). Кари Маллис, изобретатель ПЦР. Химия и Жизнь. 8;
11. R. Saiki, D. Gelfand, S Stoffel, S. Scharf, R Higuchi, et. al.. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239, 487-491;
12. C. Ledergerber, C. Dessimoz. (2011). Base-calling for next-generation sequencing platforms. Briefings in Bioinformatics. 12, 489-497;
13. 454-секвенирование (высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК);
14. Wellcome Trust: «DNA Sequencing — The Illumina Method»;
15. Обо всех РНК на свете, больших и малых;
16. Grishok A. (2005). RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932–5939;
17. Angelo Fortunato, Andrew G. Fraser. (2005). Uncover Genetic Interactions in Caenorhabditis elegans by RNA Interference. Biosci Rep. 25, 299-307;
18. Winston W.M., Molodowitch C., Hunter C.P. (2002). Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, 2456–2459;
19. C.P. HUNTER, W.M. WINSTON, C. MOLODOWITCH, E.H. FEINBERG, J. SHIH, et. al.. (2006). Systemic RNAi in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 71, 95-100.