Каким образом методами генной инженерии получают инсулин в промышленных масштабах?
Спрятать пояснение
Пояснение.
Элементы ответа:
1) Ген, кодирующий инсулин, пересаживают в кольцевые молекулы ДНК (плазмиды).
2) Рекомбинантные плазмиды вводят в бактериальные клетки. Культура таких клеток синтезирует инсулин в промышленных масштабах. (В настоящее время для получения инсулина используют дрожжи.)
Спрятать критерии
Критерии проверки:
| Критерии оценивания выполнения задания | Баллы |
|---|---|
| Ответ включает два названных выше элемента и не содержит биологических ошибок | 2 |
| Ответ включает один из названных выше элементов,
ИЛИ ответ включает два названных выше элемента, но содержит биологические ошибки |
1 |
| Ответ включает только один из названных выше элементов и содержит биологические ошибки, ИЛИ ответ неправильный | 0 |
| Максимальный балл | 2 |
19713. Установите последовательность этапов получения при помощи биотехнологии молока с белком-фактором свертываемости. Запишите в ответ соответствующую последовательность цифр.
1) помещение модифицированного ядра в яйцеклетку
2) стимуляция экспрессии гена фактора свертываемости в клетках молочной железы овцы
3) получение молока с необходимым белком
4) выделение гена фактора свертываемости крови с помощью рестриктаз
5) выращивание клона овцы, в геноме которой содержится ген фактора свертываемости
6) в ядра культивируемых соматических клеток овцы внедряют ген
P.S. Нашли ошибку в задании? Пожалуйста, сообщите о вашей находке 
При обращении указывайте id этого вопроса — 19713.
19712. Установите последовательность этапов выращивания растения. Запишите в ответ соответствующую последовательность цифр.
1) воздействие гормонов на клеточную массу
2) образование недифференцированной клеточной массы
3) помещение изолированных клеток сердцевины на питательную среду
4) из тканей сердцевины растений выделяются клетки
5) формирование вегетативных органов
P.S. Нашли ошибку в задании? Пожалуйста, сообщите о вашей находке
При обращении указывайте id этого вопроса — 19712.
19695. Установите последовательность этапов образования каллуса и регенерации растения. Запишите в ответ соответствующую последовательность цифр.
1) на поверхности каллуса формируются зеленые почки
2) помещение каллуса на питательную среду
3) получение регенерированного растения
4) образование каллуса
5) укоренение побега
6) развитие побегов с корнем
P.S. Нашли ошибку в задании? Пожалуйста, сообщите о вашей находке
При обращении указывайте id этого вопроса — 19695.
19694. Установите последовательность этапов в биотехнологии растений. Запишите в ответ соответствующую последовательность цифр.
1) отмывание и центрифугирование
2) нарезания листа на фрагменты
3) получение растения-регенерата
4) пересадка побегов для укоренения
5) выращивание колоний протопластов на питательной среде
6) добавление фрагментов в питательную среду
P.S. Нашли ошибку в задании? Пожалуйста, сообщите о вашей находке
При обращении указывайте id этого вопроса — 19694.
19693. Установите последовательность этапов клонирования. Запишите в ответ соответствующую последовательность цифр.
1) удаление ядра клетки-реципиента
2) рост эмбриона
3) подбор донора яйцеклетки
4) подсадка эмбриона суррогатной матери
5) получение клонированной овцы
6) внедрение ДНК из клетки-донора в клетку-реципиент
P.S. Нашли ошибку в задании? Пожалуйста, сообщите о вашей находке
При обращении указывайте id этого вопроса — 19693.
19692. Установите последовательность этапов клонирования, начиная с ооцита II порядка. Запишите в ответ соответствующую последовательность цифр.
1) культивирование
2) инъекция в ооцит наследственного материала овечки Долли
3) трансплантация эмбриона приемной матери
4) образование одноклеточного эмбриона
5) ооцит на стадии мейоза II
6) удаление ядра ооцита
P.S. Нашли ошибку в задании? Пожалуйста, сообщите о вашей находке
При обращении указывайте id этого вопроса — 19692.
19691. Установите последовательность этапов генной инженерии. Запишите в ответ соответствующую последовательность цифр.
1) выделение необходимого гена с помощью рестриктаз
2) трансляция
3) транскрипция
4) рекомбинантная ДНК поступает в клетку бактерии
5) полученный ген внедряют в ДНК
6) экстракция белка
P.S. Нашли ошибку в задании? Пожалуйста, сообщите о вашей находке
При обращении указывайте id этого вопроса — 19691.
19690. Установите последовательность этапов получения инсулина с помощью методов генной инженерии. Запишите в ответ соответствующую последовательность цифр.
1) синтез инсулина
2) внедрение рекомбинантной ДНК в клетку бактерии
3) экстракция и очистка инсулина
4) вырезание участка плазмидной ДНК
5) внедрение гена инсулина в наследственный материал
6) получение рекомбинантной ДНК
P.S. Нашли ошибку в задании? Пожалуйста, сообщите о вашей находке
При обращении указывайте id этого вопроса — 19690.
19578. Установите последовательность основных этапов научного исследования. Запишите в таблицу соответствующую по: тельность цифр.
1) сбор фактов и формулирование проблемы
2) получение новых фактов
3) выдвижение гипотезы
4) проверка прогнозов
5) экспериментальная проверка гипотезы
6) построение теории
P.S. Нашли ошибку в задании? Пожалуйста, сообщите о вашей находке
При обращении указывайте id этого вопроса — 19578.
19566. Установите последовательность действий экспериментатора при создании рекомбинантных плазмид. Запишите в таблицу соответствующую последовательность цифр.
1) создание фрагментов ДНК с липкими концами
2) отбор колоний бактерий с рекомбинантной плазмидой
3) внедрение фрагмента ДНК с липкими концами в плазмидную ДНК
4) использование штаммов бактерий с рекомбинантной плазмидой в производстве
5) введение рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку
P.S. Нашли ошибку в задании? Пожалуйста, сообщите о вашей находке
При обращении указывайте id этого вопроса — 19566.
Для вас приятно генерировать тесты, создавайте их почаще
Получают
плазмиды кишечной палочки – 1) ДНК
разрезаем ферментом (рестриктаза) по
липким концам. Ищет последовательность
ААТТ и режет через эти основания. Фермент
надо удалить в воде, центрифугой. 2) берем
ген ДНК человека, который надо продуцирует
инсулин. Пришиваем лигазой в ДНК, она
сшивает по липким концам. 3) Получаем
гибридную (рекомбинантную) ДНК. Отмывка
фермента центрифугированием.
Достигнутые
результаты по культивированию кл. и
тканей, и возможности получения целого
растения из 1 кл., позволили получать
растения с несвойственными им признаками
(ГМО).Вариант с 7-ю этапами: 1) поиск и
удаление нужного гена из организма
донора. 2) клонирование гена. 3) встраивание
гена в вектор трансформации растения.
4) трансформация растительной клетки
(плазмида, протопласт, каллусная ткань).
5) образование каллусной ткани путем
размножения клетки и получения побегов,
которые потом укореняют. 6) получение
целых растений. 7) проверка ГМР на
продуктивность и биобезопасность.Вариант
с 4-мя этапами: 1) Выбор гена и его
клонирование. Для трансформации берут
гены, определяющие устойчивость к
неблагопр. факторам, насекомым, гербицидам.
Берут у дикорастущего растения или
выделяют из бактерий. 2) Подбор генотипа
растения – реципиента. Берут высокоурожайные
сорта по имеющимся недостаткам. 3)
Введение гена и его экспрессия в геноме
реципиента. Перенос осущ-ся векторами.
Для двудольных – агробактериальный
вектор с ипол-м Тi-плазмиды.
4) Регенерация из клетки целого растения,
отбор трансген. раст. Для злаковых
регенерация идет хуже.
36. Получение трансгенных растений,
устойчивых к насекомым.На
сегодня такая устойчивость достигается
единственным способом — внедрением
генов из другой почвенной бактерии
Bacillus thuringiensis (Вt). Такие растения часто
называют по первым буквам латинского
названия этой бактерии (Bt-кукуруза,
Bt-хлопок). В
начале прошлого века в природе найдены
Вас. thyringiensis.
При спорообразовании образуют кристалл
токсина (яда), который убивает насекомых.
Белок в кишечнике насекомого, под
действием пищеварительных факторов
превращается в яд – прототоксин
(энтомотоксин). Выращивают бациллу,
получают споры. Используют как
биологический препарат (через 3 дня
смерть). Из генома бациллы выделен ген
Bt-2.
Он интегрируется в геном растения
методом агробактериальной трансформации
(табак, томат, картофель, соя, рис,
брокколи). Получены ГМР с тройной
устойчивостью: гербицидам, вирусам,
насекомым.Получение картофеля устойчивого
к колорад. жуку: Берем дохлые личинки
колорад. жука, погибшие от энтомотоксина.
Выделяем и сажаем в пит. среду. Отбор
колоний по черным гранулам. Отобранные
выращивает в пит. среде. Выделяем из
бактерий плазмиды, несущие ген
энтомотоксина. Плазмиды режут рестриктазой
на 4 части. Каждую часть пришивают к
плазмидам E.coli.
Выращивают E.coli,
отбирают по черным гранулам колонии.
Выделяют рекомбинантные плазмиды.
Переносят на Ти-плазмиду. Рекомб.
Ти-плазмида (селективный ген, ген
энтомотоксина, Т-область, Вир-область).
Агроб. с Ти-плазмидами добавляют к
растениям в стерильных условиях.
Регенерируют на среде с цитокининами
и антибиотиками. Конамицин убивает
клетки, трансформированные кл. устойчивы
к канамицину. Отбор. Размножение.
Проверка.Биобезопасность.
Понятие биобезопасности. Методы оценки
ГМО. Контроль за биобезопасностью.
Первые
генетически модифицированные (или
трансгенные) продукты были разработаны
американской бывшей военной компанией
Монсанто в конце 80-х годов. С 1996г. общая
площадь посевных площадей под трансгенными
культурами выросла в 50 раз и в 2005г.
составила 90 млн га (17% от общей площади).
Наибольшее количество посевных площадей
засеяно в США, Канаде, Бразилии, Аргентине
и Китае. При этом 96% всех посевных площадей
принадлежит США.Биобезопасность –
защитить человека и цивилизацию от
опасных для жизни и здоровья людей
биологических в-в, ГМО и полученных из
них продуктов.3 опасности мирового
уровня: 1) ядовитые грибы. 2) алкоголь. 3)
наркотики. ГМО и продукты из них: вновь
полученные сорта, гибриды должны пройти
лабораторный и полевой контроль, чтобы
не попали мутанты и с низкими качествами.
Должна быть Гос. система сортоиспытания,
регистрации, что снижает эту опасность.
Существует генет. риск при получении
ГМО: 1) Адресная вставка гена и его
экспрессия. Возможно получить мутанты
с токсичными, аллергенными в-ми. 2) При
трасгенезе могут проснуться «молчащие»
гены (при синтет. генах). 3) Спонтанный
перенос пыльцой ГМО в др. раст. и появление
опасных в-в.Первое растение для питания
в 1997 г. – томат. ГМО могут влиять на
репродуктивное здоровье. Мировой
терроризм исп. в своих целях
биоресурсы.Безопасность от ГМО обесп.:
1) использование природных генов. 2)
мониторинг за качеством ГМО (белков),
это позволяет не допускать опасные
генотипы к использованию 3) гос.
контроль.Методы защиты: 1)
Санитарно-гигиеническая экспертиза
(инст. пит. РАН): опред. хим. состав раст.
и ГМО, не ухудшилась ли усвояемость, не
вызывает ли аллергию, не токсично, не
мутагенно, не канцерогенно. 2) Проводят
проверку по действию на почву, вредителей.
3) Медико-биол. оценка пищ. прод. (инст.
пит., минздрав, инст. сыворотки). 4) Гос.
контроль.
Билет
19. Клональное микроразмножение растений
in
vitro.
С
давних пор существует вегет. способ
размн. Клон (отпрыск, побег, черенок) –
отпрыски растений размн. неполовым
путем и они не являются индивидуумами,
а лишь частью клона материнской особи
и идентичны ей и между собой.
Преимущества:
1) Голландия (60 млн. раст. в год), Франция
(40 млн.). Высокий коэф. размн. в год. 1 млн.
раст. из одного (Лобанова). 2) Миниатюризация
процесса, приводящая к уменьшению
площади. 3) Возможность оздоровления от
вирусных, миксоплазматических раст. и
нематод. 4) В условиях in
vitro
можно размножать растения, которые
вегет. не размн. (Гвинейская маслиничная
пальма. Французы срезали приморий
листьев (зачаточные), на пит. среде
заставили образоваться растению).
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
До применения инсулина продолжительность жизни больного сахарным диабетом составляла не более 10 лет. Изобретение этого препарата спасло миллионы пациентов. Человеческий генно-инженерный инсулин – последнее достижение науки.
Результат многолетней напряженной работы
История
До изобретения генно-инженерного (рекомбинантного) препарата инсулин выделяли из поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней.
Отличие свиного инсулина от человеческого – только одна аминокислота
Недостатки этого способа получения препарата:
- сложность хранения и транспортировки биологического сырья;
- недостаток поголовья скота;
- трудности, связанные с выделением и очисткой гормона поджелудочной железы;
- высокий риск развития аллергических реакций.
С синтезирования в биореакторе натурального человеческого инсулина в 1982 году началась новая биотехнологическая эпоха. Если на заре инсулинотерапии целью ученых было только выживание пациента, в наше время разработка новых препаратов направлена на достижение стойкой компенсации заболевания. Основная цель научных разработок – улучшить качество жизни больного сахарным диабетом.
Современные технологии
Рекомбинантный инсулин
Виды препарата в зависимости от способа получения:
| Генно-инженерный рекомбинантный | Для производства используется генетически измененная кишечная палочка.
Преимущества:
|
Любимица генетиков – кишечная палочка |
| Генно-инженерный модифицированный | Исходный материал – инсулин свиньи. Производится его модификация генно-инженерным способом. |
Структура гормона |
| Синтетический | Искусственно синтезированный препарат, по своему составу полностью идентичен человеческому инсулину. |
Производство лекарства |
Что происходит в организме после введения препарата?
Подкожная инъекция
Соединяясь с рецептором клеточной мембраны, инсулин образует комплекс, который осуществляет следующие процессы:
- Улучшает внутриклеточную транспортировку глюкозы и облегчает ее усваивание.
- Способствует выделению ферментов, которые участвуют в переработке глюкозы.
- Снижает скорость образования в печени гликогена.
- Стимулирует жировой и белковый обмен.
В случае подкожного введения инсулин начинает действовать через 20-25 минут. Время действия препарата от 5 до 8 часов. В дальнейшем расщепляется ферментом инсулиназой и выводится с мочой. Препарат не проникает через плаценту и не попадает в грудное молоко.
Когда назначают генно-инженерный инсулин?
Если необходима срочная помощь
Генно-инженерный человеческий инсулин применяется в следующих случаях:
- Сахарный диабет 1 или 2 типа. Используется в качестве самостоятельного лечения или в комплексе с другими препаратами.
- При резистентности к пероральным сахароснижающим средствам.
- При диабете у беременных женщин.
- В случае осложнений со стороны почек и печени.
- При переходе на инсулин пролонгированного действия.
- В предоперационном периоде.
- В случае развития угрожающих жизни состояний (гиперосмолярной или кетоацидотической комы).
- В экстренных ситуациях (перед родами, при травмах).
- Если имеются дистрофические поражения кожи (язвы, фурункулез).
- Лечение сахарного диабета на фоне инфекции.
Человеческий генно-инженерный инсулин хорошо переносится и не вызывает аллергических реакций, так как полностью идентичен природному гормону.
Важен постоянный контроль!
Запрещено назначение лекарства в случае:
- снижения уровня сахара в крови;
- повышенной чувствительности на препарат.
В первые дни после назначения препарата необходимо внимательное наблюдение за пациентом.
Побочные эффекты
Крапивница
Опасность! Отек Квинке!
В редких случаях при применении инсулина возможны следующие осложнения:
- аллергические реакции (крапивница, отек Квинке, зуд кожи);
- резкое снижение уровня сахара в крови (развивается из-за отторжения препарата организмом или в случае иммунологического конфликта);
- нарушения сознания;
- в тяжелых случаях возможно развитие гипогликемической комы;
- жажда, сухость во рту, вялость, снижение аппетита;
- гипергликемия (при применении препарата на фоне инфекции или лихорадки);
- покраснение лица;
- местные реакции в области введения (жжение, зуд, атрофия или разрастание подкожной жировой клетчатки).
Иногда адаптацию к препарату сопровождают такие нарушения, как отеки и нарушения зрения. Эти проявления, как правило, исчезают через несколько недель.
Как найти в аптеке генно-инженерный инсулин?
Лекарство выпускается в виде раствора для парентерального введения:
| «Биосулин» |
Средняя продолжительность действия |
| «Актрапид» |
Инсулин короткого действия |
| «Генсулин» |
Двухфазный препарат (комбинация инсулинов короткой и средней продолжительности действия) |
| «Ринсулин» |
Быстрый эффект |
| «Хумалог» |
Для введения лекарства используется шприц-ручка |
Подобрать препарат инсулина с учетом индивидуальных особенностей пациента не составит труда.
Важно! Назначать инсулин может только врач! Он же рассчитывает дозу и контролирует состояние пациента во время курса лечения. Самолечение может привести к трагическим последствиям.
Правила использования
Чаще всего применяется подкожное введение инсулина.
Формирование складки
В неотложных случаях лекарство вводится внутривенно.
При тяжелом состоянии пациента
Даже диабетик со стажем может допустить ошибку при применении препарата.
Для того, чтобы избежать осложнений, необходимо:
- Перед использованием проверить срок годности лекарства.
- Соблюдать рекомендации по хранению: запасные флаконы должны храниться в холодильнике. Начатый флакон можно хранить при комнатной температуре в темном месте.
- Убедитесь, что хорошо запомнили нужную дозировку: еще раз прочитайте рецепт врача.
- Перед инъекцией обязательно выпустить воздух из шприца.
- Кожа должна быть чистой, но использовать спирт для обработки нежелательно, так как он снижает эффективность препарата.
- Выбрать оптимальное место для инъекции. При введении под кожу живота препарат подействует быстрее. Медленнее всасывается инсулин при введении в ягодичную складку или плечо.
- Использовать всю площадь поверхности (профилактика развития местных осложнений). Расстояние между инъекциями должно быть не меньше 2 см.
- Захватить кожу в складку, чтобы снизить риск попадания в мышцу.
- Шприц вводить под кожу под углом, чтобы лекарство не вытекло.
- При инъекциях в живот инсулин короткого действия вводить за 20 минут до приема пищи. В случае выбора плеча или ягодицы – за тридцать минут до еды.
Сочетание с другими лекарственными средствами
Зачастую при сахарном диабете больной принимает несколько медицинских препаратов. Сочетание с другими лекарственными средствами может оказать влияние на лечебное действие генно-инженерного инсулина.
Для профилактики осложнений необходимо знать:
| Увеличивают эффект генно-инженерного инсулина, понижая сахар в крови |
|
|
| Уменьшают действие инсулина |
|
Обратите внимание!
Мочегонное |
Передозировка
В некоторых случаях введение инсулина приводит к внезапному снижению уровня сахара в крови. Проблема часто возникает из-за неправильного подбора дозы препарата.
Критический уровень
Начальные симптомы гипогликемии:
- слабость;
- бледность кожи;
- состояние тревоги;
- головокружение;
- дезориентация;
- онемение рук, ног, языка и губ;
- дрожь конечностей;
- холодный пот;
- сильное чувство голода;
- головные боли.
Тремор
Внезапное ухудшение самочувствия
Если вы заметили у себя подобные симптомы, нужно быстро съесть что-нибудь, содержащее легкоусвояемые углеводы. Это может быть печенье, конфета, кусочек сахару или белого хлеба. Хорошо помогает в таких ситуациях сладкий чай.
При ухудшении состояния необходимо вызвать скорую помощь. Гипогликемия может закончиться комой или смертью пациента.
Врачебная помощь: струйное вливание в вену 40% раствора глюкозы, введение глюкагона.
Частые вопросы врачу
Применение генно-инженерного инсулина при беременности
Добрый день! Меня зовут Снежана. С детства страдаю сахарным диабетом. В последнее время использую «Актрапид». Несколько дней назад узнала о своей беременности. Я боюсь, что генно-инженерный препарат может повлиять на развитие ребенка, вызвать какие-нибудь мутации. Скажите пожалуйста, может мне заменить лекарство?
Здравствуйте, Снежана. Человеческий генно-инженерный инсулин не проникает через плаценту и совершенно безопасен при беременности. Вам нужно обратиться к эндокринологу для того, чтобы скорректировать дозу.
Опасен ли рекомбинантный инсулин?
Добрый день! Врач назначил колоть «Хумалог Микс 25». Но на упаковке написано, что он рекомбинантный! Это что же, я буду вводить себе ГМО? Прочитал в интернете, что эти продукты вызывают рак.
Здравствуйте! Рекомбинантный инсулин ничем не отличается от природного. Для получения его используются генно-модифицированные бактерии.
С помощью технологий генной инженерии производится вживление рекомбинантной ДНК, содержащей ген инсулина, в клетку кишечной палочки. Генно-модифицированные организмы размножаются и вырабатывают гормон. Препарат очень эффективен и отличается высокой степенью очистки.
Автор статьи:
AI56kavAI56kav
- Авторы
- Резюме
- Файлы
- Ключевые слова
- Литература
Кужекина Ю.С.
1
Воробьева А.С.
1
Василенко С.А.
1
Купша Е.И.
1
1 Медицинская академия им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского»
Генную инженерию как один из разделов биотехнологии относят к числу приоритетных наук, открывающих безграничные возможности, как для биологии, так и для клинической медицины. Применение методов в генной инженерии в лечение таких заболеваний, как сахарный диабет, может стать настоящим прорывом в науке и медицине, так как сахарный диабет – это заболевание, которое становится все более распространенным в наше время. На сегодняшний день важнейшим достижением биотехнологии является разработка и применение в клинической практике фармацевтических препаратов, полученных с помощью генетической инженерии, которые в последующем будет применяться в медицинской практике. В статье собраны и проанализированы сведения о достижениях методов генной инженерии в лечении сахарного диабета.
генная инженерия
сахарный диабет
инсулин
инсулин-продуцирующие клетки.
1. Бабаев А.А., Ежова Г.П., Новикова Н.А., Новиков В.В. Генная терапия: коррекция генетической информации. //Учебно-методические материалы по программе повышения квалификации «Хранение и обработка информации в биологических системах». Нижний Новгород. 2007
2. Генная инженерия и мутации [Электронный ресурс] // slideshare .– URL: http://www.slideshare.net/olik5sch/ss-49493623
3. Дедов И.И., Балаболкин М.И., Клебанова Е.М.. Современные аспекты трансплантации островков поджелудочной железы при сахарном диабете.
Сахарный диабет. 2004. № 2. С. 34-41.- URL: http://www.voed.ru/sc_24.htm
4. Комаров С.С. Введение в биотехнологию [Электронный ресурс]: учебно-методическое пособие / С.С. Комаров. — Электрон. текстовые данные.— Бийск: ООО «Издательский дом «Бия», 2016. – 40 с. — URL: http://elibrary.ru/item.asp?id=26065050
5. Шереметьева М.Е., Бухарова Т.Б., Гольдштейн Д.В. Гены & Клетки: Том XI, №1, 2016 год, стр.: 24-34.- URL: http://genescells.ru/article/insulin-produtsiruyushhie-kletki-v-lechenii-insulinozavisimogo-saharnogo-diabeta/
6. Agnieszka Stryjewska1 , Katarzyna Kiepura1 , Tadeusz Librowski2 , Stanis³aw Lochyñski3 Biotechnology and genetic engineering in the new drug development. Part I. DNA technology and recombinant proteins. Pharmacological Reports. 2013, 65, 10751085. ISSN 1734-1140.- URL: http://www.if-pan.krakow.pl/pjp/pdf/2013/5_1075.pdf
7. Matsubayashi Y. Small Post-Translationally Modified Peptide Signals in Arabidopsis. The Arabidopsis Book / American Society of Plant Biologists. 2011;9:e0150. doi:10.1199/tab.0150.- URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3268502/
8.Nabih A Baeshen, Mohammed N Baeshen, Abdullah Sheikh, Roop S Bora, Mohamed Morsi M Ahmed, Hassan A I Ramadan, Kulvinder Singh Saini, and Elrashdy M Redwan. Cell factories for insulin production. Microb Cell Fact. 2014.- URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4203937/
9. Qian X, Kraft J, Ni Y, Zhao F-Q. Production of recombinant human proinsulin in the milk of transgenic mice. Scientific Reports. 2014.- URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4179469/
21 век – время грандиозных по своему масштабу открытий в медицине. Изобретение новых препаратов для лечения гемофилии, вакцин, гормонов, иммунокоррегирующих веществ, расшифровка человеческого генома, – далеко не весь перечень научных открытий, созданных с помощью генной инженерии. Достижения генной инженерии в эндокринологии вот уже более 20 лет остаются в центре внимания медицинского сообщества в связи с тем, что распространение сахарного диабета (СД) в последние годы получило характер эпидемии. По данным Международной федерации диабета в 2014 г. в мире зарегистрировано 387 млн больных, ожидается, что к 2035 г. их количество увеличится до 592 млн. Только в РФ насчитывается 3,5 млн больных сахарным диабетом, однако в реальности это число может достигать 9 млн человек. [4]
Результаты генно-инженерных исследований, от производства рекомбинантного человеческого инсулина до имлантации инсулин-продуцирующих клеток, полученных из собственных клеток пациента, позволяет полагать, что разработка ряда эффективных методов лечения инсулинозависимого СД становится реальностью.
Открытие инсулина Ф. Бантингом и его коллегами в 1921 г. привело к значительному прогрессу в лечении инсулинозависимого СД: продолжительность жизни после постановки диагноза увеличилась с 1,3 года до 45 лет. Однако, успешное лечение СД очищенным бычьим инсулином сопровождалось неблагоприятными побочными эффектами: воспалением, формированием абсцессов в месте введения, в дополнение к потенциально смертельным аллергическим реакциям, а недостаточная степень очистки приводила к ошибкам в дозировании препарата. Несмотря на это, очищенный бычий инсулин был основным препаратом для лечения СД вплоть до начала 1980 годов. В то же время стремительно стала развиваться генная инженерия, позволяющая конструировать рекомбинантные ДНК вне биологических систем (in vitro), а затем вводить их в геном другого организма. [2]
В основе получения человеческого инсулина также лежит использование методов генной инженерии. Аминокислотная последовательность человеческого инсулина была разработана Фредериком Сенгером еще в 1958 г. Как известно, инсулин состоит из двух пептидных цепей А и В, связанных двумя дисульфидными мостиками между аминокислотами цистеина, присутствующими в этих двух цепях, третий дисульфидный мостик находится в цепи А. Уже через 20 лет человеческий инсулин был создан с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Рекомбинантный человеческий инсулин синтезируется методом внедрения ДНК каждой цепи инсулина отдельно в ДНК ослабленных неинфекционных штаммов бактерий E.coli. После многократных циклов деления, бактерии могут производить множество копий каждой цепи инсулина. Индивидуальные цепи молекулы инсулина извлекают из бактерий и очищают. После очистки молекулы рекомбинантного инсулина, для улучшения её функции, проводят замещение одной аминокислоты в молекуле. Эти изменения способствуют производству инсулина быстрого или длительного действия. Рекомбинантный человеческий инсулин, получаемый с использованием в E.coli и Saccharomyces cerevisiae, не вызывает опасных побочных эффектов, отмечаемых при использовании инсулина животного происхождения.
Более эффективный метод, также с использованием E.coli, включает в себя производство проинсулина, а не отдельных фрагментов его синтеза. Как известно, синтез инсулина in vivo и его выделение представляют собой сложный многоэтапный процесс. Первоначально образуется неактивный предшественник гормона, проинсулин, который после ряда химических превращений переходит в активную форму. В процессе созревания из молекулы проинсулина с помощью специфических эндопептидаз вырезается C-пептид — фрагмент из 31 аминокислоты, соединяющий B-цепь и A-цепь, таким образом молекула проинсулина разделяется на инсулин и биологически инертный пептидный остаток. Ген, кодирующий проинсулин, трансфицируют в клетки E.coli, где он в дальнейшем экспрессируется. Полученный гормон очищается, а цепь С протеолитически удаляется. [5]
Привлекательной системой экспрессии, которая может быть использована для производства инсулина в промышленных масштабах для терапевтического применения у человека как в парентеральной, так и в пероральной и ингаляционной формах, являются трансгенные растения. Рекомбинантный человеческий инсулин успешно экспрессируется и продуцируется в масличных культурах Резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana). Эта технология включает целенаправленную экспрессию инсулина в субклеточных структурах, известных как oilbodies, которые состоят из гидрофобного ядра триацилглицерина, заключенного в капсулу из фосфолипидной мембраны и наружной оболочки протеинов, известных как олеозины. Затем oilbodies отделяются от других компонентов семян, и рекомбинантный инсулин отщепляют от ассоциации с олеозином. Последующее созревание для получения биологически активного инсулина может быть осуществлено с использованием стандартных ферментативных методов. Масличные могут также выступать в качестве естественного клеточного склада, где рекомбинантный инсулин может быть складирован до тех пор, пока потребуется. [6]
В других исследованиях были получены трансгенные растения, в которых человеческим проинсулином трансформировали хлоропласты табака и салата-латука. Обнаружено, что листья табака накапливают до 47%, а листья салата до 53% проинсулина от общего белка листьев. Проинсулин, содержащийся в листьях салата оказался очень стабильным, около 40% проинсулина обнаруживается даже в стареющих и высушенных листьях. Затем проинсулин экстрагируют и расщепляют с помощью протеаз. Доказано, что пероральное введение мышам необработанного проинсулина, инкапсулированного в растительной клетке, приводит к снижению уровня глюкозы в крови, подобно введению коммерчески доступных инсулинов. При этом получение инсулина с использованием трансгенных растений обладает рядом преимуществ: экономическая эффективность, отсутствие человеческих патогенов, простота производства и наличие эукариотической машин для посттрансляционных модификаций. [7]
Не менее интересны эксперименты по производству высоких уровней человеческого проинсулина в молоке трансгенных мышей, несущих кДНК человеческого инсулина с экпрессией, приводимой в действие промотором гена — козьим β-казеином. Уровень экспрессии человеческого проинсулина в молоке была максимальной в средине лактации и достигала 8,1 г/л. При этом уровни глюкозы в крови и уровни инсулина, так же как и состав молока были неизменными, и трансгенные животные не имели видимых дефектов здоровья. Зрелый инсулин, полученный из проинсулина молока сохранял свою биологическую активность. [8]
Исследования последних лет направлены на поиск возможности замещения утраченной функции инсулярного аппарата, нормализации регуляции углеводного обмена и полный отказ от экзогенного введения инсулина. Реальную возможность излечения от СД 1 типа дает аллогенная трансплантация островков поджелудочной железы: гистологически подтверждено, что островки человека, трансплантированные в печень, способны к выживанию в течение нескольких лет при отсутствии признаков отторжения и рецидива аутоиммунного процесса. Однако, для успешной функции пересаженной островковой ткани в портальную систему необходимо ввести достаточное количество островков, способных секретировать инсулин в среде с гипергликемией: высокая эффективность этого метода была продемонстрирована при пересадке более 11000 островков на 1 кг массы тела больного.
Другие проблемные аспекты – это необходимость проведения иммуносупрессивной терапии, тестирование доноров на вирусы гепатита, ЦМВ и ВИЧ инфекцию, защита островков от бактериальной и грибковой контаминации. [3]
Реальной альтернативой аллогенной трансплантации является генная терапия, позволяющая направленно изменять генные дефекты путем введения нормальных генов в клетки пациентов. Для эффективной доставки чужеродного гена в клетки-мишени используют вирусные векторы, обладающие способностью к активной трансдукции и длительной экспрессии чужеродного гена. В качестве клеток — мишеней используются лимфоциты, клетки красного костного мозга, опухолей, печени и др. [1]
В последнее время предпринимаются попытки разработать генетическую конструкцию, способную автономно функционировать по принципу «обратной связи» и секретировать адекватное содержанию глюкозы количество инсулина. В эксперименте получен клон иммортализированных β -клеток островков Лангерганса, трансфицированных геном р-галактозы, который в течение 9 мес. способен был секретировать инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой. Такие «инженерные» β-клетки сохраняли свою функциональную активность при подкожном, внутрикожном и внутримышечном введении экспериментальным животным. Методом селекции клеток инсулиномы был получен усовершенствованный клон, резистентный к -интерферону и интерлейкину-1 β, опосредующим иммунный ответ.
На 61 конгрессе Американской диабетической ассоциации сообщалось о возможности генно-инженерных конструкций осуществлять контроль экспрессии гена инсулина в нейроэндокринных клетках кишечника. В исследовании с экспериментальным СД у крыс модифицированная кДНК проинсулина человека вместе с аденоассоциированным вирусным вектором помещалась в специальную кассету. Через 6-8 часов после перорального приема этой кассеты у диабетических животных отмечалось снижение глюкоземии, затем длительно сохранялось эугликемическое состояние, опосредованное, вероятно, трансдукцией гепатоцитов. Продемонстрирована также возможность использования в качестве продуцентов инсулина генетически измененных печеночных клеток. При помощи вектора ЦМВ в гепатоциты HEP G2 и HUH7 введена кДНК инсулина человека. Трансфицированные клетки секретировали проинсулин человека, адекватно изменению уровня глюкозы. После имплантации диабетическим мышам они продолжали продуцировать инсулин, обеспечивая нормальное содержание глюкозы сыворотки крови. [3]
Открытие белка, являющегося транскрипционным фактором (PDX-1 или IDX-1/STF-1/IPF-1), контролирующим развитие поджелудочной железы и транскрипцию гена инсулина является еще одним толчком для генной терапии СД. Фактор PDX-1 экспрессируется не только в период эмбриогенеза, но и во взрослом состоянии, что сопровождается неогенезом островков и дифференцировкой инсулинпродуцирующих (ИПК) клеток из прогениторных клеток. Предложено использование экзогенного PDX-1 для стимуляции транскрипции гена инсулина и дифференцировки под его влиянием in vitro и in vivo стволовых панкреатических клеток человека в ИПК. Превращение инсулинпродуцирующей стволовой клетки (ИПСК) в ИПК достигалось путём последовательного многостадийного воздействия на клетки факторов цитодифференцировки, при этом отмечалась экспрессия панкреатических генов PDX1 и NKX6-1. Такие клетки были способны выбрасывать кальций в ответ на добавление в среду глюкозы, упаковывать инсулин в секреторные гранулы, секретировать инсулин в количествах, близких с таковыми у зрелых β-клеток, в ответ на множественные эпизоды добавления глюкозы. В экспериментах in vivo ИПК после трансплантации диабетическим мышам проявили способность контролировать уровень глюкозы в крови.
В настоящее время интенсивно ведутся разработки устройства ViaCyte, предоставляющего собой макроконтейнер со средой для развития, поддержки и обеспечения жизненных потребностей ИПК, обладающий полупроницаемыми стенками, способными пропускать инсулин, кислород и питательные вещества, но препятствующими проникновению клеток. Данный эффект обеспечивает, как протекцию трансплантированных клеток от аутоиммунной атаки, так и защиту организма реципиента от их потенциально возможного туморогенного действия. Сообщается о разрешении FDA на начало клинических испытаний по трансплантации ViaCyte как перспективного вида СД 1 типа без подавления иммунитета и без риска гипогликемии и других осложнений, связанных с диабетом [4].
Подытоживая вышесказанное, можно отметить, что результаты исследований в сфере генной инженерии позволяют не только удовлетворить потребности в инсулине больных СД 1 типа, нуждающихся в заместительной терапии, но и делают возможным возобновление утраченных функций инсулярного аппарата и нормализацию углеводного обмена и его регуляции.
Библиографическая ссылка
Кужекина Ю.С., Воробьева А.С., Василенко С.А., Купша Е.И. ДОСТИЖЕНИЯ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ В ЛЕЧЕНИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА // Международный студенческий научный вестник. – 2017. – № 6.
;
URL: https://eduherald.ru/ru/article/view?id=17882 (дата обращения: 11.03.2023).
Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)